【正文】 吸附劑：在表面上能夠發(fā)生吸附作用的固體。 金屬離子和離子強(qiáng)度： Mn2+、 Fe2+、 Co2+、 Zn2+等陽離子能與蛋白質(zhì)中的羧基、氨基和含有氮雜環(huán)的化合物結(jié)合，形成難溶復(fù)合物，有利于沉淀。需冷卻、降溫、低溫操作。 28 等電點(diǎn)沉淀法應(yīng)在低離子強(qiáng)度下操作。不同蛋白質(zhì)鹽析所需離子強(qiáng)度不同。 ③等電點(diǎn)沉淀法：用于氨基酸、蛋白質(zhì)及其他兩性物質(zhì)的沉淀。 26 授課章節(jié) 第六章 沉淀法和吸附法 學(xué)時(shí) 2 教學(xué)目標(biāo)與要求 1. 掌握沉淀法 分離生物物質(zhì)的原理和 方法 2. 掌握 吸附 法分離生物物質(zhì)的原理和方法 教學(xué)重點(diǎn)與難點(diǎn) 1. 生成鹽復(fù)合物沉淀； 。 滾壓 ：將原料滾壓成片，使其減小到 o． 1 一 o． 5mm，則大豆及許多植物種子的細(xì)胞壁極大地破裂，植物油容易進(jìn)入溶劑。 分離蛋白質(zhì)時(shí)， 使用最多的是陰離子型表面活性劑 AOT。 反膠團(tuán)的微小界面和微小水相具有兩個(gè)特 異性功能： (1)具有分子識(shí)別并允許選擇性透過的半透膜的功能； (2)在疏水性環(huán)境中具有使親水性大分子如蛋白質(zhì)等保持活性。 1）表面自由能的影響 2）表面電荷的影響 3）綜合考慮 4）影響分配平衡的參數(shù) (1)聚合物的影響； (2)體系中無機(jī)鹽離子的影響； (3)體系 PH 的影響； (4)體系溫度的影響； (5)體系中微生物的影響?；旌戏肿娱g如存在空間排斥力，它們的線團(tuán)結(jié)構(gòu)無法互相滲透，則在達(dá)到平衡后就有可能分成兩相，形成雙水相。 聚合物的不相溶性： 主要是由于聚合物分子的空間阻礙作用，相互間無法滲透，當(dāng)聚合物的濃度達(dá)到一定值時(shí)，就不能形成單一的水相，所以具有強(qiáng)烈的相分離傾向。 ③與其他非水相有機(jī)溶劑中的酶催化反應(yīng)相比， SC—C02 更適合與生物、食品相關(guān)的產(chǎn)品體系，產(chǎn)物分離簡(jiǎn)單。如在 C02 中添加約 14％的丙酮后，甘油酯的溶解度增加 22 倍。 三、 超臨界 CO2 的溶劑特征 １、超臨界 CO2 的相圖： 在臨界點(diǎn)附近，密度線聚集于臨界點(diǎn)周圍，壓力或溫度小范圍的變化，就會(huì)引起 CO2 密度的大幅度變化。 也有人將超臨界流體萃取稱為 “超臨界氣體萃取 ”或 “高密度氣體蘋取 ”的，這雖不如前者嚴(yán)格，但有時(shí)卻有利于理解超臨界流體的蘋取原理。 2．破乳化 由蛋白質(zhì)引起的乳化多為 O/ W 型，其粒徑在 2． 5—30 微米之間。復(fù)合物又要容易分解。 (1)pH 值 直接影響表觀分配系數(shù)。 4．分配定律和分離因數(shù) 分配定律：在一定溫度一定壓力的條件下，溶質(zhì)分配在兩個(gè)互不相溶的溶劑中，達(dá)到平衡時(shí) 溶質(zhì)在兩相中的活度之比為一常數(shù)。故 AB(3)型溶劑的氫鍵性質(zhì)與 N 型或 B 型相似 。 2．溶劑的互溶性規(guī)律 物質(zhì)分子之間的作用力與物質(zhì)種類有關(guān)，包括較強(qiáng)的氫鍵力和較弱的范德華力。 第一節(jié)、溶劑萃取法 第二節(jié)、超臨界流體萃取法 第三節(jié)、雙水相萃取法 第 四節(jié)、反膠團(tuán)萃取法 第五節(jié)、浸取法 第一節(jié) 溶劑萃取 溶劑萃取法是利用一種溶質(zhì)組分 (如產(chǎn)物 )在兩個(gè)互不相溶的液相 (如水相和有機(jī)溶劑相 )中競(jìng)爭(zhēng)性溶解和分配性質(zhì)上的差異來進(jìn)行分離的操作。 (2)細(xì)胞外形保持完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進(jìn)一步提取。 2．自溶法 ： 影響自溶過程的主要因素有溫度、時(shí)間、 pH、激活劑和細(xì)胞代謝途徑等。 超聲破碎的效率與聲頻、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度及菌種類型等因素有關(guān)。 細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與細(xì)胞破碎：細(xì)胞個(gè)體小、球形、壁厚、聚合物交聯(lián)程度高是最難破碎的。但有些目的產(chǎn)物存在于細(xì)胞內(nèi)部、如大多數(shù)酶蛋白、類脂和部分抗生素等，稱為胞內(nèi)產(chǎn)物。其操作特點(diǎn)是使懸浮液在過濾介質(zhì)表面作切向流動(dòng)，利 用流動(dòng)的剪切作用將過濾介質(zhì)表面的固體(濾餅 )移走，過濾速率就近似恒定。 1．板框過濾機(jī) 2． 真空轉(zhuǎn)鼓過濾機(jī) 3．硅藻土過濾機(jī) 硅藻土：較純二氧化硅礦石。 缺點(diǎn)：設(shè)備投資高、能耗大。 (2) 變性法 ：使蛋白質(zhì)變性的方法很多，如：加熱，調(diào)節(jié) PH，有機(jī)溶劑，表面活性劑等。 凝聚值：使膠粒發(fā)生凝聚作用的最小電解質(zhì)濃度。 方法選擇 ： 對(duì)于胞外產(chǎn)物，經(jīng)預(yù)處理應(yīng)盡可能使目的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到掖相，然后經(jīng)固液分離除去固相；對(duì)于胞內(nèi)產(chǎn)物，則應(yīng)首先收集菌體或細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞破碎后 ,目的產(chǎn)物進(jìn)入液相，隨后再將細(xì)胞碎片分離。溶液離子強(qiáng)度增加，離子間相互作用變?nèi)?，氫鉸也受到同樣影響。 ZnSO4 和黃血鹽用于除去雜氨基酸和雜蛋白。酶分子正是通過對(duì)底物的多點(diǎn)識(shí)別才顯示出它高效、專一的底物識(shí)別功能。 均質(zhì)膜并非絕對(duì) “均質(zhì) ”，也會(huì)有布朗運(yùn)動(dòng)和反混現(xiàn)象。 吸附相＝狹義吸附相 +毛細(xì)管凝結(jié)相 4．粒子充填床層中的物質(zhì)擴(kuò)散 實(shí)體粒子充填床層內(nèi)的擴(kuò)散現(xiàn)象與多孔體內(nèi)的情況基本相同。 1．傳遞通量 流體在分離場(chǎng)內(nèi)的傳遞現(xiàn)象可用經(jīng)典流體力學(xué)中動(dòng)量 (通量 )傳遞、熱量 (通量 )傳遞和質(zhì)量 t 通量 )傳遞規(guī)律 (見表 2—4)和作用于分離場(chǎng)的外加勢(shì)能場(chǎng)來描述。 P c= — =Sp H C—固體中的溶質(zhì)濃度 P——?dú)庀嗳苜|(zhì)分壓 H——亨利常數(shù) S——溶解度系數(shù) CD∞ Kp 全吸收量 C = CH+CD=Sp+ ———— 1+Kp CH— 亨利型吸收量 CD — 吸附型吸收量 CD∞ — 最大吸附型吸收量 (事實(shí)上為一常數(shù)） K — 常數(shù) 四、傳遞現(xiàn)象 平衡 (包括擬平衡 )操作中，分離體系在達(dá)到平拖之前，要 經(jīng)歷一個(gè)非平衡過程。 F=C 一 P 十 2 F—自由度； C—組分?jǐn)?shù)； P—相數(shù)。 二、分類 以物理學(xué)過程為基礎(chǔ)的分離操作，大致可分為以下三類： 1． 平衡分離過程 建立在相平衡關(guān)系上的。 ?清潔生產(chǎn)工藝是生產(chǎn)全過程控制工藝，包括節(jié)約原材料和能源，淘汰有毒害的原材料，并在全 部排放物和廢物離開生產(chǎn)過程以前，盡最大可能減少它們的排放量和毒性，對(duì)必須排放的污染物實(shí)行綜合利用，使廢物資源化。 (4)成品制作： 成品形式與產(chǎn)品的最終用途有關(guān)，有液態(tài)產(chǎn)品也有固態(tài)產(chǎn)品，美觀的產(chǎn)品形態(tài)也是產(chǎn)品檔次的一個(gè)標(biāo)志。 產(chǎn)品安全性：當(dāng)生物技術(shù)產(chǎn)品是食品或藥物時(shí)，溶媒的使用受到一定的限制，應(yīng)考慮它們?cè)谄焚|(zhì) 5 或氣味上是否污染產(chǎn)物。 產(chǎn)品濃度很低：一些新興生物技術(shù)產(chǎn)品，待處理物料中產(chǎn)品濃度很低，往往低于雜質(zhì)含量，如 L—異亮氨酸為 ％，青霉素為 ％，每千克產(chǎn)品中核黃素僅含幾克、胰島素僅含幾十毫克，而且對(duì)熱、 PH、有些甚至對(duì)光不穩(wěn)定。 很多工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)品，包括現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品，其質(zhì)量的優(yōu)劣、成本的高低、競(jìng)爭(zhēng)力的大小，往往與下游技術(shù)直接相關(guān)。 第一節(jié) 生物工業(yè)下游技術(shù)的工作領(lǐng)域 一、技術(shù)范疇 從 “下游技術(shù) “的含義上來說，除 “物質(zhì)分離 ”外，還涉及到 “產(chǎn)品加工 ”，目前人們理解的下游技術(shù)大多數(shù)屬于 “物質(zhì)分離 ”范疇。 易揮發(fā)和氧化：用萃 取技術(shù)提取有效成分 (風(fēng)味物質(zhì) )時(shí)，如啤酒花需要先進(jìn)行粉碎， 般粉碎機(jī)的機(jī)械沖擊點(diǎn)處溫度高達(dá) 300℃左右，風(fēng)味物質(zhì)極易揮發(fā)和氧化造成損失。萃取及色譜的分離介質(zhì)甚至于膜分離技術(shù) 中膜材料的選擇，有時(shí)也受到限制。 第三節(jié) 生物工業(yè)下游技術(shù)的發(fā)展動(dòng)態(tài) 一、傳統(tǒng)分離技術(shù)的提高和完善 蒸餾、蒸發(fā)、過濾、離心、結(jié)晶和離子交換等傳統(tǒng)技術(shù)由于應(yīng)用面廣且相對(duì)成熟，對(duì)它們的提高和完善將會(huì)推動(dòng)大范圍的技術(shù)進(jìn)步。 6 授課章節(jié) 第二章 下游技術(shù)的理論基礎(chǔ) 學(xué)時(shí) 2 教學(xué)目標(biāo)與要求 1. 了解 下游技術(shù)中的物理學(xué)過程 2. 了解 下游技術(shù)中的化學(xué)過程 3. 了解 下游技術(shù)中的 生物 學(xué)過程 教學(xué)重點(diǎn)與難點(diǎn) 1. 平衡論； ； 。利用相的組成差別進(jìn)行混合物體系的分離。 2 ．氣液平衡 非理想溶液： pi＝ pi*ai= pi*ri xi ； 式中： pi* —純組分 i 的飽和蒸氣壓； a i—組分 i 的活度，而 ai ＝ ri xi ； ri—組分 i 的活度系數(shù)．可由有關(guān)公式求得。趨向平衡態(tài)的速度取決于體系內(nèi)各組分的質(zhì)量傳遞的阻力。 存在異相傳遞的情況下，物質(zhì)在異相之間的境界膜中的擴(kuò)散速度往往成為物質(zhì)傳遞速度的限制性因素。例外的情況是，當(dāng)粒子充填層中的空隙比多孔體粒子內(nèi)空隙大得多時(shí)，會(huì)引起流體透過方向上的返混。 多孔性膜基本上與多孔體內(nèi)質(zhì)量傳遞相同。 環(huán)狀糊精也有一定的分子識(shí)別功能。 產(chǎn)品制造： 氨基酸或短肽能絡(luò)合或螯合某些金屬離子生產(chǎn)保健產(chǎn)品。 (5)試劑： 在試劑中，尿素、鹽酸肌、十二烷基磺酸鈉等會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象造成影響。 第一節(jié) 發(fā)酵液過濾特性的改變 微生物發(fā)酵液的特性可歸納為： ①發(fā)酵產(chǎn)物濃度較低，大多為 1％一 10％，懸浮掖中大部分是水； ②懸浮物顆粒小，相對(duì)密度與液相相差不大； ③固體粒子可壓縮性大； ④液相粘度大，大多為非牛頓 型流體； ⑤性質(zhì)不穩(wěn)定，隨時(shí)間變化，如易受空氣氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影響。反離子的價(jià)數(shù)越高，該值就越小，即凝聚能力越強(qiáng)。其中最常用的是加熱法。此外，連續(xù)排料時(shí)，固相干度不如過濾設(shè)備。化學(xué)性能穩(wěn)定，具有極大的吸附和滲透能力，是良好的介質(zhì)和助濾劑。 (1)用泵循環(huán)使懸浮液流經(jīng)過濾介質(zhì)。 許多基因工 程產(chǎn)品都是胞內(nèi)產(chǎn)物。 第二節(jié) 常用破碎方法 方法很多，按其是否使用外加作用力可分為機(jī)械法和非機(jī)械法兩大類。對(duì)不同菌種的發(fā)酵液．超聲破碎的效果差別較大。微生物細(xì)胞的自溶法常采用加熱法或干燥法。 缺點(diǎn)： (1)通用性差，某種試劑只能作用于某些特定類型的細(xì)胞。 優(yōu)點(diǎn)：比化學(xué)沉淀法分離程度高；比離子交換法選擇性好、傳質(zhì)快；比蒸餾法能耗低。氫鍵力與化合鍵能相比較弱，但比范德華力要強(qiáng)得多。 3．溶劑的極性 溶劑萃取的關(guān)鍵是萃取溶劑的選擇，而選擇的依據(jù)是 “相似相溶 ”的原則。如果是稀溶液，活度可用濃度代替，則達(dá)到平衡時(shí)溶質(zhì)在兩相中的濃度之比為一常數(shù)。對(duì)選擇性有影響。 二、工業(yè)萃取方式和理論收得率 工業(yè)上萃取操作通常包括三個(gè)步驟： (1)混合 (2)分離 (3)溶劑回收 20 1．單級(jí)萃取 萃取操作理論收得率的計(jì)算須符合以下兩個(gè)假定： (1)萃取相和萃余相很快達(dá)到平衡，即每一級(jí)都是理論級(jí)； (2)兩相完全不互溶，在分離器中能完全 分離。親水基團(tuán)強(qiáng)度大于親油基團(tuán)。 二、 超臨界流體的蘋取原理 真空 “溶解 ”物質(zhì)的能力極低。由于 CO2 溶解、萃取物質(zhì)的能力與 CO2 本身的密度成正比，這就意味著只要通過改變壓力或溫度來改變?nèi)軇?CO2 的密度，就可以改變其對(duì)物質(zhì)的溶解能力。純 C02 幾乎不能從咖啡豆中萃取咖啡因，但在加濕 (水 )的SC—C02 中，因?yàn)樯?了具有極性的 H2CO3，在一定的條件下，能選擇性地溶解萃取極性的咖啡因。 22 ④與萃取一樣， SC—C02 中的質(zhì)量傳遞速度快，在臨界點(diǎn)附近，溶解能力和介電常數(shù)對(duì)溫度和壓力敏感，可控制反應(yīng)速度和反應(yīng)平衡。 另外，某些聚合物的溶液與某些無機(jī)鹽的溶液相混合時(shí)，只要濃度達(dá)到一定值，也會(huì)形成兩相，即聚合物 —鹽雙水相體系，成相機(jī)理尚不清楚，一種解釋為 “鹽析 ”作用。 相圖 水性兩相的形成條件和定量 關(guān)系常用相圖表示。 23 二、 雙水相萃取技術(shù)的應(yīng)用 雙水相萃取技術(shù)目前較多地應(yīng)用于胞內(nèi)酶的提取和精制上。 反膠團(tuán)萃取的優(yōu)點(diǎn)： (1)有很高的萃取率和反蘋取率并具有選擇性； (2)分離、濃縮可同時(shí)進(jìn)行，過程簡(jiǎn)便； (3)能解決蛋白質(zhì) (如胞內(nèi)酶 )在非細(xì)胞環(huán)境中迅速失活的問題； (4)由于構(gòu)成反膠團(tuán)的表面活性劑往往具有細(xì)胞破壁功效，因而可直接從完整細(xì)