【正文】 ? 加速保藏試驗(yàn)可用于預(yù)測保藏過程中保藏培養(yǎng)物的穩(wěn)定性 。 質(zhì)?；蛲ǔ樗拗骷?xì)胞生長非必需 。 ?可用于絲狀真菌 、 酵母 、 細(xì)菌和放線菌的保藏 。 其他保藏方法 一、傳代保藏 二、礦物油中浸沒保藏 一、傳代保藏 ?將菌種定期在新鮮瓊脂培養(yǎng)基上傳代 ， 然后在一定的生長溫度下生長和保存的傳代保藏方法 。 13． 關(guān)閉真空泵 。 將安瓿與歧管相聯(lián)后迅速置于醇浴中 ， 然后調(diào)節(jié)溫控裝置 。 而且經(jīng)凍干后的菌株無需進(jìn)行冷凍保藏 ， 便于運(yùn)輸 。 (二 )液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟 1．待冷凍保藏菌種懸液的制備 (1)從生長斜面制備菌懸液：每一斜面加入 5ml含 10％甘油的營養(yǎng)液體培養(yǎng)；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌體細(xì)胞懸液； ～ lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶， (2)從浸沒培養(yǎng)物制備菌懸液： 在浸沒培養(yǎng)液中加入等體積 20%無菌甘油；輕輕振蕩混勻培養(yǎng)液，如果菌體絮凝較緊，則需先用玻璃珠打散； 藏專用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口；將所有封好的安瓿置于 5℃ 冰箱中 3min，以使細(xì)胞和懸浮培養(yǎng)基之間達(dá)到平衡。 ? 這一方法雖簡便易行 ， 但不適宜多數(shù)微生物的長期保藏 。 為了獲得滿意的冷凍結(jié)果 ， 通常應(yīng)在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護(hù)劑 。 ? 3) 誘導(dǎo)抑制劑法：有些化合物能阻止某些誘導(dǎo)酶的合成，當(dāng)在誘導(dǎo)物和誘導(dǎo)抑制劑同時(shí)存在的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)待分離菌群時(shí)，誘導(dǎo)型菌株不能產(chǎn)生誘導(dǎo)酶，無法正常生長，只有組成型變異株能夠利用底物進(jìn)行生長繁殖。 具體的篩選方法有恒化器法、循環(huán)培養(yǎng)法和誘導(dǎo)抑制物法。 菌種篩選的手段 ? 初篩 ? 從菌體形態(tài)變異分析 ? 平皿快速檢測法 具體的有紙片培養(yǎng)顯色法、變色圈法、透明圈法、生長圈法和抑制圈法等 ? 搖瓶培養(yǎng)法搖瓶培養(yǎng)法也可用于初篩。 ? 如果認(rèn)為是有實(shí)用前途的代謝產(chǎn)物 ， 則要進(jìn)一步大量培養(yǎng) ， 并進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn) 、 毒性考查 、 藥物代謝等實(shí)驗(yàn) ， 并進(jìn)行提高發(fā)酵水平和改善提取工藝的工作 ， 以備投入生產(chǎn) 。 ? 這種直接確定代謝產(chǎn)物用途的方法亦稱動(dòng)物體內(nèi)治療試驗(yàn) 。 ? 4．酶處理溫度 ? 5．破壁時(shí)的 pH值 ? 6．滲透壓穩(wěn)定劑 等滲透壓在原生質(zhì)體制備中，不僅起到保護(hù)原生質(zhì)體免于膨裂，而且還有助于酶和底物的結(jié)合，滲透壓穩(wěn)定劑多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有機(jī)物和 KCl和 NaCl等無機(jī)物。 為的是確證融合的成功 ， 可以采用多標(biāo)記菌種 。 2． 原生質(zhì)體制備 。 一、原生質(zhì)體融合育種的特點(diǎn) (一 )雜交頻率較高：細(xì)胞壁去除后在高滲條件下形成類似于球形的原生質(zhì)體 。 兩種交配型細(xì)胞經(jīng)其細(xì)胞壁上特定的凝聚因子誘導(dǎo)而進(jìn)行交配 ，恢復(fù)為雙倍體；同一交配型細(xì)胞之間 ， 則因細(xì)胞壁上凝集因子的存在而不能進(jìn)行交配 。 ? 三 、 菌落快速裂解鑒定法 ? 從平板上直接挑選菌落裂解后 ， 直接電泳檢測載體質(zhì)粒大小 ， 判斷有無插入片段存在 ， 該法適于插入片段較大的重組子初篩 。 重組克隆的篩選與鑒定 ? 基因克隆的最后一步是從轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌落中篩選出含有陽性重組子的菌落 ， 并鑒定重組子的正確性 。 根據(jù)所采用的載體的性質(zhì) ， 將重組 DNA分子導(dǎo)入受體可有不同的方法 。 ? 使 DNA解鏈（高溫），引物結(jié)合于基因的兩端（低溫），在合適溫度下開始合成（鏈延長）反應(yīng)。 載體應(yīng)具備以下條件： ? １、能在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中復(fù)制； ? ２、具有多種限制酶的單一切點(diǎn)（即所謂多克隆位點(diǎn)）以便外源 DNA插入； ? ３、具有篩選標(biāo)志以區(qū)別陽性與陰性重組分子； ? ４、載體分子較小，以便體外基因操作，同時(shí)載體 DNA與宿主 DNA便于分離； ? ５、對于表達(dá)型載體還應(yīng)具有與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、加尾信號等基因表達(dá)元件。 12．以不同的量涂布選擇培養(yǎng)基平板。 3．將 mol／ L CaCl2溶液、試管及吸管在冰浴中冷卻。 質(zhì)粒 DNA分子常呈現(xiàn)三種形態(tài)；常見的一種是共價(jià) 、 閉環(huán)狀 DNA(CCC DNA)；其次是由于 1條鏈有缺口而產(chǎn)生的開環(huán) DNA(ocDNA)；第三種是由雙環(huán)分子兩段均斷裂而產(chǎn)生的線性 DNA。 1個(gè)平皿測一個(gè)菌 。 ? 此法結(jié)果明確 ， 但工作量大 。 ? 2． 將完全培養(yǎng)基上長出的全部菌落在絲絨上輕輕一壓 ， 使之成為印模 ， 標(biāo)記方位 。 ? 目前生產(chǎn)氨基酸 、 核苷酸的菌種都是各種類型的缺陷型 。 2． MNNG溶液的制備 用分析天平稱取 2mg， 加入2ml ／ L pH ， 于暗處振蕩溶解 。 5．取照射菌液 2 ml于液體培養(yǎng)基中 (300 ml三角瓶內(nèi)裝 30 ml培養(yǎng)液 )， 120 r／ min振蕩培養(yǎng) 4～6 h。 ? 由于紫外線照射后有光復(fù)活效應(yīng)，所以照射時(shí)和照射后的處理應(yīng)在紅燈下進(jìn)行。 ? 復(fù)篩則是精選 ， 以質(zhì)為主 ， 也就是以精確度為主 。 (二 )處理菌懸液的制備 ? 這一步驟的關(guān)鍵是制備單細(xì)胞和單孢子狀態(tài)的 、活力類似的菌懸液 ， 為此要進(jìn)行合適培養(yǎng)基的培養(yǎng) ， 并要離心 ， 洗滌 ， 過濾 。 但它可能影響鄰近基因的性能 。 而用電離輻射工作時(shí) ， 設(shè)備費(fèi)用大 ， 并要注意安全性 。 ? 誘變育種：以誘發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)的育種 ， 是迄今為止國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量 、 性能的主要手段 。 (6)消除代謝產(chǎn)品的反饋抑制 。 ? (3)改良菌種的評價(jià) (包括實(shí)驗(yàn)規(guī)模和工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模 )。 二、 pH ：介質(zhì) pH影響生活環(huán)境中 營養(yǎng)物質(zhì)的可給態(tài)和有毒物質(zhì)的毒性 ；影響 菌體細(xì)胞膜 的帶電荷性質(zhì)、膜的穩(wěn)定性及膜對物質(zhì)的吸收能力 ； 使 菌體表面蛋白變性或水解 。 表示。 （ 3）縮短和消除遲緩期的方法有： 增加接種量 、 采用最適種齡 、 選用繁殖速度快的菌種 以及 盡量保持接種前后所處的培養(yǎng)基介質(zhì)和條件一致。 先制備含實(shí)驗(yàn)菌的平板，然后以無菌濾紙片蘸取各放線菌的搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵液或切取一定大小的放線菌瓊脂培養(yǎng)塊，置于含菌平板上，培養(yǎng)后觀察有無抑菌圈產(chǎn)生。 次代培養(yǎng)及純化 ? 菌落形成后可根據(jù)肉眼可見的菌落形態(tài)上的差異 ，作初步的鑒定和區(qū)分 。 培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的共同特點(diǎn) 碳源、氮源、無機(jī)元素、生長因子、水、氧氣 一、培養(yǎng)基的類型和用途 據(jù)來源 天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基 主要成分或使用目的 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基 據(jù)生產(chǎn)工藝 孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基 二、培養(yǎng)基的選擇 據(jù)微生物的特點(diǎn)來選擇 細(xì)菌、酵母菌、霉菌、放線菌 據(jù)發(fā)酵方式選擇培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基 從生產(chǎn)實(shí)踐和科學(xué)試驗(yàn) 種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基 從經(jīng)濟(jì)效益方面考慮選擇生產(chǎn)原料 價(jià)廉、來源豐富、運(yùn)輸方便 三、培養(yǎng)基的配制原則 1. 據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基 2. 營養(yǎng)成分的恰當(dāng)配比 3. C/N 4. 滲透壓 5. PH 四、培養(yǎng)基成分配比的選擇 1. 參照前人所使用的某一類菌種培養(yǎng)基的經(jīng)驗(yàn)配方 2. 結(jié)合菌種和產(chǎn)品的特性 3. 確定初始配方 4. 對碳源、氮、無機(jī)鹽、前體等種類和量進(jìn)行逐個(gè)單因子試驗(yàn) 5. 觀察對菌體生長、產(chǎn)物合成的影響 6. 綜合考慮各種因素，得到適合的菌種配方 7. 對其結(jié)果加以驗(yàn)證 8. 最終確認(rèn)最佳配方 四、培養(yǎng)基成分配比的選擇 對代謝途徑清楚的主要代謝產(chǎn)物，可以根據(jù)物料平衡加以確定 如：青霉素發(fā)酵 ? 微生物所需要的物質(zhì) 碳源、氮源、無機(jī)元素、生長因子、水、氧氣 ? 在發(fā)酵工業(yè)中、必須使用廉價(jià)的原料來配制培養(yǎng)基，并且盡量滿足以下要求 1. 消耗每克底物將產(chǎn)生最大的菌體得率或產(chǎn)物得率 2. 能產(chǎn)生最高的產(chǎn)品或菌體的濃度 3. 能得到產(chǎn)物的最大速率 4. 副產(chǎn)品的得率最小 5. 價(jià)廉并且有穩(wěn)定的質(zhì)量 6. 來源豐富且供應(yīng)充足 7. 通氣和攪拌、提純、廢物處理等生產(chǎn)工藝較容易 8. 另外培養(yǎng)基的選擇還會影響發(fā)酵罐的設(shè)計(jì) （ 1）糖 （ 2）脂肪 （ 3）醇、有機(jī)酸 （ 4）碳?xì)浠衔? 除此之外，酒精、有機(jī)酸、烷烴等含碳物質(zhì)越來越引起人們的重視。 除嗜溫性放線菌外 ， 其他放線菌一般在培養(yǎng) 420天內(nèi)在分離平板上緩慢形成菌落 。 這些特性包括形態(tài) 、 培養(yǎng)特征 、 營養(yǎng)要求 、 生理生化特性 、發(fā)酵周期 、 產(chǎn)品品種和產(chǎn)量 、 耐受最高溫度 、 生長和發(fā)酵最適溫度 、 最適 pH值 、 提取工藝等 。 二、分離思路 ? 新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求 、 菌種的特性 ， 采用各種篩選方法 ， 快速 、準(zhǔn)確地把所需要的菌種挑選出來 。如短桿菌的短桿菌素 S，枯草芽孢桿菌的枯草桿菌肽，多粘芽孢桿菌的多粘菌素等，對動(dòng)物有毒性，只限外用。 真菌抗生素 ? 真菌抗生素主要是青霉和產(chǎn)黃青霉產(chǎn)生的青霉素，灰黃青霉產(chǎn)生的灰黃霉素。低濃度抑菌，高濃度殺菌。 采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生新抗生素 （ 1）基因克隆產(chǎn)生新抗生素：首先獲得某已知抗生素的結(jié)構(gòu)基因，然后通過一定的載體將基因片段導(dǎo)入特定的另一種抗生素產(chǎn)生菌中，則可能產(chǎn)生完全符合人們設(shè)計(jì)要求的新抗生素。 ? 增殖： 人為地通過控制養(yǎng)分或培條件 ， 使所需菌種增殖培養(yǎng)后 ， 在數(shù)量上占優(yōu)勢 。 ? 采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后 ， 用小薩子除去表土 ， 取離地面 515cm處的土約 10g， 盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中 ， 扎好 ， 標(biāo)記 ， 記錄采樣時(shí)間 、地點(diǎn) 、 環(huán)境條件等 ， 以備查考 。 培養(yǎng)基 是提供微生物生長繁殖和生物合成各種代謝產(chǎn)物所需要的 ,按一定比例配制的多種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。 ? 植物體上放線菌的分離：無菌取植物組織，干燥以減少細(xì)菌數(shù)量，剪碎植物材料后植入平板表層后培養(yǎng)。 篩選模型： 是指篩選工作中所使用的實(shí)驗(yàn)菌。如 設(shè)法縮短遲緩期、延長對數(shù)期以及在穩(wěn)定期收集菌體。 （ 3）功能：產(chǎn)生 次生代謝產(chǎn)物 （抗生素、生物堿、色素等）、芽孢；對穩(wěn)定期的研究發(fā)展了 連續(xù)培養(yǎng)技術(shù) 。 最低生長溫度 三種基本溫度 最適生長溫度 最高生長溫度 根據(jù) 生長溫度 分類： 1. 嗜冷微生物 ：其所含 的 酶 在低溫能有效地催化生化反應(yīng)；在低溫下主動(dòng)運(yùn)輸 仍能正常進(jìn)行，有效的吸收必須的營養(yǎng)物質(zhì)，是其 原生 質(zhì)膜中含有較多的不飽和脂肪酸 ，在低溫下仍可維持膜 的 流動(dòng)性 。 通過改造 ， 可使現(xiàn)存的優(yōu)良性狀強(qiáng)化 ， 或去除不良性質(zhì)或增加新的性狀 。 (3)改變代謝途徑 ， 減少無用副產(chǎn)品的生成以及提高菌種對高濃度的有潛在毒性的底物 、 前體或產(chǎn)品的耐受力 。 ? b. 由另一菌株的高效低能代謝途徑代謝來實(shí)現(xiàn) 。 化學(xué)誘變劑中使用最多 、 最有效的是烷化劑 。 3． 吖啶類誘變劑可以造成生化代謝途徑的完全中斷 。 5．要盡量選擇單倍體細(xì)胞、單核或核少的多細(xì)胞體來作出發(fā)誘變細(xì)胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。 這樣 ， 隱性的變異就會顯現(xiàn)出來 ， 若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng) ， 直接在平皿上分離就會出現(xiàn)變異和不變異細(xì)胞同時(shí)存在于一個(gè)菌落內(nèi)的可能 ， 形成混雜菌落 ， 以致造成篩選結(jié)果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化 。 一般我們常以細(xì)胞的死亡率表示 ， 希望照射的劑量死亡率控制在 70～ 80%為宜 。 在正式照射前 ， 應(yīng)先開紫外線 10 min， 讓紫外燈預(yù)熱