【正文】 l M TrisHCl, pH 2 ml 10% SDS 2 mg 蛋白酶鉀 (加入細(xì)胞前加入 ) TE (10 mM TrisHCl pH 。 片，分割后 ,迅速在液氮中浸泡凍結(jié) .這些切片可以儲(chǔ)存在 70c，哺乳動(dòng)物組織培養(yǎng)細(xì)胞中也可以使用 .約有 108細(xì)胞每毫升裝 . 這將給予比較多肝臟的 DNA反應(yīng)數(shù)量 . 本議定書的 DNA 產(chǎn)量 510毫克 ). . K至 100毫克 /毫升溶液在 55℃上 緩慢加入肝顆粒到溶液中 ,并避免顆?；旌显谝黄?. 寬大口燒杯可能比窄口瓶好 ，避免顆粒混合在一區(qū) . 輕輕旋轉(zhuǎn)在 55℃孵化 3小時(shí) . 100毫升苯酚 . 在離心機(jī) 1800xg(3000rmp 貝克曼 TJ6)離心一分鐘后分離到 250毫升瓶中 . 水提取層用丁 醇，濃縮的 DNA 約 189。 pH39。 use 1:1000 Kanamycin: , use 1:1000 only for cells with [pREP4] plasmid! ORDERING INFO Sigma: Glutathione beads, cat G4510 Sigma: Thrombin, 3560 NIH units/mg protein, cat T6759 ICN: AEBSF: 193503 NOTES bME should be freshly added when called for, as it is rapidly oxidized. PMSF should be added just prior to lysis of bacteria, as it is unstable in aqueous solutions. Instead of PMSF try lesstoxic AEBSF. Stock solution: in H2O, use 1:100 nSec1, a sticky protein, gives a higher yield if NaCl is added to the resuspension buffer and % Tween20 to the Thrombin Cleavage Buffer. Since the resuspension buffer is already 150mM NaCl just add NaCl. If you intend to freeze the pressed lysate, leave in the cell debris. Centrifuge it out prior to purification. Stirred Cell Concentrator: Soak new filter in ddH20 1 hour. Store at 4C in 20% ethanol 蛋白質(zhì)凝膠電泳 方法原理 :蛋 白質(zhì)凝膠電泳用于分析蛋白質(zhì)樣品 ,尤其在蛋白質(zhì)變性條件下用于凈化含有超過一種蛋白質(zhì)的混合物中特定成分 ,如核酸電泳法 ,每一個(gè)蛋白質(zhì)的荷質(zhì)比決定其通過凝膠的遷移速率 .由于碳骨干分子是不帶負(fù)電荷的 ,負(fù)電荷是由加入的 SDS為載體 ,凝膠電泳及緩沖區(qū) 等提供的 .負(fù)電荷的 SDS 結(jié)合蛋白骨架并變成蛋白質(zhì)的一部分 ,SDS的數(shù)量與每一個(gè)蛋白質(zhì)的分子量成正比 ,其遷移率經(jīng)電泳與分子量成正比 .但是分子量小于 10KD的蛋白質(zhì) ,不具有與 SDS 結(jié)合的能力 ,因此需要根據(jù)分子量的不同改變電泳條件 .電泳價(jià)加入核酸和蛋白質(zhì)融合也可要求改變電泳條件 以適應(yīng)不同分子量大小的樣品 .出現(xiàn)這種情況的原因是 ,核酸成分常常有助于絕大多數(shù)均分子量和負(fù)電荷的分子融合 ,從而改變這些分子的電泳特性 .在這里 ,我首先要討論怎樣編寫和運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)凝膠 ,這一標(biāo)準(zhǔn)通常用于電泳大部分的蛋白質(zhì) ,接著我將討論修改可用于分析小分子量的蛋白質(zhì)或多肽的核酸蛋白電泳 . 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)凝膠電泳 原料 Invitrogen has 10% (SDS) Acrylamide gels for sale if you have Biorad mini gel Electrophoresis equipment. 30% Acrylamide stock (:1 acrylamide:bisacrylamide) Tris Base and Hydrochloric Acid SDS Ammonium Persulfate TEMED Glycine EDTA 50% Glycerol bMercaptoethanol Bromophenol Blue PreStained Molecular Weight Markers (optional)。 進(jìn)行限制性酶切之前使用 proteinase K 處理 PCR 產(chǎn)品可以有效提高接下來的酶聯(lián)反應(yīng) .使用 SYBR Safe DNA Gel Stain 是比較安全，同時(shí)也可以有效減少 ethidium 溴化物的致癌作用。要求所使用的 buffer 味道聞起來像 wet dog( 檢查 DTT 是否完好） 。 C 變性 10 min . 電穿孔透析 20 min . Use disks shiny side up 20 176。在平行試驗(yàn)中做更多的嘗試以獲得最好的結(jié)果是非常必要的。 連接酶反應(yīng)中兩種 DNA 組分的濃度大約是 100μ g/ml。這是 OWW 上的主動(dòng)權(quán) ,請(qǐng)主動(dòng)提供你的想法并與負(fù)責(zé)人的想法保持一致。 將溶解產(chǎn)物 column 上過兩次可以將產(chǎn)量提高 20% 。這可能用 所使用的一些挑剔的酵素有關(guān)系。 注意事項(xiàng) : 由于 buffer PE 中剩余的乙醇可能影響后來的生化酶促反應(yīng)，去除 flowthrough，棄去剩余buffer，純化。 (可選擇的 ): 加入 ml Buffer PB 沖洗 QIAprep spin column ，離心 30~60sS，去除 flowthrough. 加入 endA+ （如 JM series , HB101 及其派生物、野生型株菌等具有高 nuclease 酶活性或高碳水化合 物的物質(zhì)）。如果必需的 , 繼續(xù)顛倒 tube 管直到反應(yīng)液變成黏和澄清。 這個(gè) 實(shí)驗(yàn) 可以用來純化洗凈來自 1– 5 ml 過夜培養(yǎng)的 E. coli in LB (LuriaBertani) medium 的精確 到 20 μ g的高副本 plasmid DNA。 C 孵育 1 小時(shí) 。 置于冰上，并導(dǎo)入到活化 E. coli 中。 實(shí)施階段 使用 PCR Taq polymerase 及你自己的實(shí)驗(yàn)方案。 C 孵化 515min。然而，如果非特異性 PCR 產(chǎn)物要獲得預(yù)期的產(chǎn)物就要求復(fù)性溫度樓梯式升高 12 176。 C 條件下變性 足以讓 DNA 完全變性了。若 DNA 變性不完全，則在第一次循環(huán)擴(kuò)增周期模板有效利用率降低和 PCR 產(chǎn)物的準(zhǔn)確度過低中造成模板的失效。 Fermentas 純化試劑盒 dNTP 混合物， 2mM(R0241/2) 和 10mM(R0191/2),方便的在 PCR 中被為直接的使用制定。 5. 安置樣品在 thermocycler,進(jìn)行 PCR. 反應(yīng)混合物的組分 模板 DNA 通常數(shù)量模板脫氧核糖核酸是在 為質(zhì)?；蚴删拿撗鹾颂呛怂岷? g范圍內(nèi)為 genomic 脫氧核糖核酸，為 50μ l總反應(yīng)混合物。 PCR 反應(yīng)試劑應(yīng)該被分開的準(zhǔn)備而且專門為該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的。 entry clone III. Transformation IV. Protocol: QIAprep Spin Miniprep Kit Using a Microcentrifuge V. DNA ligation VI. DNA gel extraction and purification V II. DNA enzyme digestion V III. GST Fusion Protein Prep 課件與幻燈片 1. 分子生物學(xué)臨床診斷應(yīng)用 2. 非典型肺炎和 AIV PCR 只提供超過 10一個(gè)目標(biāo)脫氧核糖核酸序列的百萬個(gè)拷貝的生產(chǎn)從少量分子。 二 .配制反應(yīng)混合體系 。 C，因此必須適當(dāng)選擇 GC的含量比例及長度 ； dNTPs 反應(yīng)混合體系中的 dNTP 的濃度通常是 200μ M. 它要求反應(yīng)體系中每一 dNTP(dATP 、 dCTP 、 dGTP,dTTP) 的濃度均相同 , 如果某一種 dNTP 的濃度不平衡增加反應(yīng)時(shí)將會(huì)大大增加 DNA 聚合酶錯(cuò)配機(jī)率。 C) 。 C 變性 時(shí)間沒有達(dá)到 3min， Taq DNA 聚合酶錯(cuò)配的幾率增加。此外 , 可用 dGTP 7 deaza 替代反應(yīng)體系中的 dGTP，從而降低 PCR 產(chǎn)品的熔化溫度。 對(duì)于模板 DNA 小于 10 ，循環(huán)次數(shù)一般為 40 個(gè)。 entry clone Invitrogen TOPO TA cloning kit 以下程序是供有經(jīng)驗(yàn)的 TOPO174。對(duì)于 electroporation ，稀釋 4fold 鹽溶液。 chemicallypetent E，小心混勻 . 冰上孵育 5 到 30 分鐘。 如果你以前從未做這個(gè)記錄 , 在手冊中讀背景數(shù)據(jù)。 加入 250 μ l Buffer P2 并且顛倒 tube 46 次混勻。就會(huì)形成一個(gè)壓的白色圓球。 加入 ml 的 Buffer PE 沖洗 QIAprep spin column ，離心 30 ~60 s。在某些情況下，這樣可以有效提高樣品中 DNA 的濃度。我們可以使用室溫水來獲得比較好的 產(chǎn)品，使用 Knight lab 去離子水洗脫也可以獲得比較好的產(chǎn)品。旋轉(zhuǎn)穿越只能降低對(duì)一個(gè)混合之后殘余的鹽水平，為比較好的解決這個(gè)難題 ,我使用約 300500 μ L PE進(jìn)行兩次洗滌 . 第一次洗滌的時(shí)候 ,我沿著反應(yīng)管內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)使沾在加樣槍表面的反應(yīng)液脫落到反應(yīng)管中。這一酶素用于連接 DNA 片段鈍性末端或平末端 ,粘性末端。 mono ，容易產(chǎn)生質(zhì)粒聚合體，如果過低那麼結(jié)果可能是線的和圓形的 homo 和 heteropolymers。 加入適量的宿主載體。 L