【正文】 所以 DNA片段組合將是大勢所趨，特別是作為重點(diǎn)研究的 DNA片段組合還需更加深入、全面的研究。能夠用于鑒定近似物種，在形態(tài)學(xué)上很難區(qū)分其形態(tài)特征的種群。通過他人大量基于 GenBank的基因關(guān)于植物的遺傳關(guān)系研究成果表明，此法是行之有效的。但顯然對所有 DNA 進(jìn)行分析是不切實(shí)際的，工作量極大是不可能完成，所以我們只能選擇相對較小但是進(jìn)化速率較快，比較具有代表性的，能區(qū)分植物種類并對其作遺傳關(guān)系分析的 DNA 作 DNA 條形碼。第一大組含有 1 種狗尾草屬植物，是 ，第二大組分為兩個(gè)亞屬，第一亞屬只有 ，第二亞屬中只有 親緣比較遠(yuǎn)，其它植物親緣比較近。 23種紫草屬 ndhF基因的長度為 305~596bp，最短的 ，最長的 ， G+C含量為 %~% ，多數(shù)為%。 物種拉丁文名 中文名 ndhF 長度 /bp (C+G)/% GenBank序號 ———— 2020 % ———— 2017 % ———— 2043 % ———— 2043 % ———— 2043 % ———— 2034 % ———— 2042 % ———— 2034 % ———— 2043 % ———— 2032 % ———— 2043 % ———— 2043 % 第二章 實(shí)驗(yàn)方法 17 ———— 2043 % ———— 2043 % ———— 2022 % ———— 2034 % ———— 2042 % 大蘆穗 2043 % 紅女王 2043 % 雞矢藤 2021 % 榿樹 2036 % 數(shù)據(jù)分析 運(yùn)用 Clustal X 程序?qū)?:序列進(jìn)行對位排列 , 個(gè)別位點(diǎn)做必要的人工校正。 MEGA 它主要集中于進(jìn)化分析獲得的綜合的序列信息。 ndhF是葉綠體功能基因，該基因共含有 21個(gè)編輯位點(diǎn) , 且這 21個(gè)位點(diǎn)均為部分編輯。 自 2020年開展植物 DNA條形碼研究以來 , 共有 9個(gè) DNA片段即 : ITS(Kress et al., 2020)、 rbcL (Newmaster et al., 2020。在生命條形碼概念提出之初 ,生物學(xué)家希望能找到一個(gè)基因或者一小段 DNA序列就可以區(qū)別地球上所有的物種 , 即 one gene for allspecies。一 個(gè)理想的 DNA條形碼 , 必須在不同研究類群中具有通用性、適當(dāng)?shù)男蛄虚L度、直接測序即可獲得高質(zhì)量的序列、有良好的物種分辨能力等特性。雜交被認(rèn)為是引起物種快速分化的一個(gè)重要原因 , 因此快速進(jìn)化通常伴隨著頻繁的雜交 , 使得重建系統(tǒng)發(fā)育困難 , 目前仍是系統(tǒng)進(jìn)化研究中的難點(diǎn)。主要原因如下 : (1) 序列數(shù)據(jù)不足或序列 “噪音 ”的影響。譜系重排在核基因家族的進(jìn)化中很普遍 , 在葉綠體基因組上也存在。主要有如下幾種情況 : (1) 基于同一核基因位點(diǎn)的系統(tǒng)樹上 , 同一種內(nèi)的基因序列在系統(tǒng)樹的位置沖突 , 即種內(nèi)序列并非單系 。因此 , 僅選用其中一種來源的 DNA序列無法全面揭示雜交和異源多倍化等系統(tǒng)進(jìn)化問題。近年來隨著 DNA 測序技術(shù)自動(dòng)化水平的不斷的提高 ,由于這種方法具有快速、高效、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為植物分子系統(tǒng)學(xué)研究領(lǐng)域方面的基石 ,在進(jìn)化研究和植物系統(tǒng)發(fā)育 中應(yīng)用的越來越廣泛。 ⑤ 《重慶草藥》：治目疾流淚起霧。 ① 《綱目》：治疣目，貫發(fā)，穿之即干滅也。作為西藥的功能抗病原微生物作用、抗炎作用、對心血管系統(tǒng)的作用、避孕作用、抗腫瘤作用及其它作用。若長期食用，還有 “利血?dú)?、輕身、延年 ”的功效。對眩暈、頭痛、耳鳴有防治作用。南京人以菊葉做菜入湯。 狗尾草初生時(shí)是小小的細(xì)細(xì)的一到兩片的嫩葉，遠(yuǎn)望去幾乎不見。穎果灰白色。種子借風(fēng)、灌溉澆水及收獲物進(jìn)行傳播。內(nèi)藏，花絲短，花藥長圓形，藥隔 有時(shí)伸出成一短尖頭；子房 4裂，胚珠 4顆；小堅(jiān)果 4，平滑或有小疣體。 8世紀(jì)前后，作為觀賞的菊花由我國傳至日本，被推崇為日本國微的圖樣。另外，NCBI研究者還堅(jiān)持推動(dòng)與 NIH內(nèi)部其他研究所及許多科學(xué)院和政府的研究實(shí)驗(yàn)室的合作。數(shù)目巨大的分子數(shù)據(jù)和這些數(shù)據(jù)的 隱秘而精細(xì)的模式使得計(jì)算機(jī)化的數(shù)據(jù)庫和分析方法成為絕對的必須。 GenBank 數(shù)據(jù)庫和 NCBI GenBank 是一個(gè)有來自于 70,000多種生物的核苷酸序列的數(shù)據(jù)庫。菊科所含有的倍半萜內(nèi)酯類具有強(qiáng)心、抗癌、驅(qū)蟲、鎮(zhèn)痛等作用。植物擁有 3 套基因組 , 按進(jìn)化速率由快到慢依次為核基因組 ( nDNA) 、葉綠體基因組( cpDNA) 和線粒體基因組 (mtDNA) (Wolfe et al. , 1987) 。 論文基于 ndhF 序列對幾種植物進(jìn)行了遺傳關(guān)系分析。 隱存種的發(fā)現(xiàn)、識(shí)別及形成機(jī)制是分類學(xué)研究的一個(gè)難點(diǎn)。 NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中心 )理解自然無聲但精妙的關(guān)于生命細(xì)胞的語言是現(xiàn)代分子生物學(xué)的要求。他們一起用數(shù)學(xué)和計(jì)算的方法研究在分子水平上的基本的生物醫(yī)學(xué)問題。頭狀花序上盤花和邊花同時(shí)存在或缺邊花。為短日照植物，在每天，每天 12小時(shí)以上的黑暗與 10℃ 的夜溫適于花芽發(fā)育。中國北方 4~5月出苗 ,以后隨澆水或降雨還會(huì)出現(xiàn)出苗高峰 。稈直立或基部膝曲，高 10100cm，基部徑達(dá) 37mm?；ü谙那镩g?？梢允秤?、茶用 、藥用。有散風(fēng)清熱、清肝明目和解毒消炎等作用。對肝火旺、用眼過度導(dǎo)致的雙眼干澀也有較好的療效。作為中藥的功能主治涼血，活血，解毒透疹。色素成分為萘醌衍生物， 有紫草素（紫草醌， Shikonin）、乙酰紫草素（ Acetylshikonin）、去氧紫草素第一章 引 言 7 （ Deoxyshikonin）、異丁基紫草素（ Isobutyshi konin）、異戊酰紫草素（ Isovalerylshikonin）、 β， β二甲基丙烯酰紫草素（ β， βDimethyla crylshikonin）、β羥基 異戊酰紫草素 （ βHydroxyisovalerylshikonin）、紫草烷（ Alkannan）、紫草紅（ Alkannin）、 α甲基 正 丁酰紫草素（ αMethylnbutyrylshikonin）、 3， 4二甲基戊烯 3?；喜蒗?Teracrylshikonin）． 新疆假紫草根含 β羥基異戊酰紫草醌、 3,4二甲基戊烯 3?；喜蒗舅嶂饕獮檐浿?、油酸及亞油酸等。又用治麻 (疣 )子。 20世紀(jì) 70年代基因銀行的建立積累了大量的 DNA 序列信息 , PCR技術(shù)的不斷發(fā)展又使得在基因水平研究植物的遺傳變異成為可能 ,從而極大地推動(dòng)了分子系統(tǒng)學(xué)的發(fā)展 , 使得系統(tǒng)發(fā)育研究水平達(dá)到了一個(gè)相當(dāng)高的地步。 DNA 序列在植物分子系統(tǒng)學(xué)研究中的發(fā)展 由 DNA 單一序列分析向多序列分析發(fā)展 在早期的植物分子系統(tǒng)學(xué)研究中大多僅選用一種來源的 ( nDNA或 cpDNA) 甚至一個(gè) DNA片段作為數(shù)據(jù)來源。因此 , 低拷貝核基因 (Low2copy nuclear gene, LCNG) 因其豐富的資源和較快的進(jìn)速率被廣泛的開發(fā)和應(yīng)用。其次 , 需考慮選用的 DNA片段的進(jìn)化速率和進(jìn)行系統(tǒng)分析時(shí)選用的替代模式是否妥當(dāng)。 而雜交及多倍化事件是植物進(jìn)化過程中固有的。如基于多種 DNA序列的研究發(fā)現(xiàn)薔薇科蘋果亞科的各分類群經(jīng)歷了早期快速分化 , 表現(xiàn)為系統(tǒng)樹上的短枝。也有研究表明應(yīng)用 AFLP標(biāo)記反而可以解決 nDNA和cpDNA序列難于澄 清的系統(tǒng)關(guān)系問題綜上所述 , 當(dāng)基于 DNA序列所構(gòu)建的系統(tǒng)樹因支持率低或存在沖突而并不能解決系統(tǒng)關(guān)系時(shí) ,應(yīng)對序列數(shù)據(jù)進(jìn)行全面的分析 , 包括對譜系重排、基源 /種源拷貝、重組子和假基因拷的檢驗(yàn)和判斷 , 并結(jié)合已知的植物遺傳背景或進(jìn)化史 , 采取相應(yīng)的有效措施進(jìn)行改善 , 才能正確地揭示分類群內(nèi)的系統(tǒng)關(guān)系、推斷植物分化過程中經(jīng)歷的復(fù)雜進(jìn)化史。 就整體而言 , 在植物類群中條形碼的研究和應(yīng)用尚處于探索階段 , 稍落后于對動(dòng)物類群的研究。 建庫后 , 驗(yàn)證要以形態(tài)分類學(xué)結(jié)果作為參照標(biāo)準(zhǔn)。 Erickson, 2020)、 matK (Chase et al.,2020。對于 DNA條形碼的研究和發(fā)展我們還有一定的路要走。 ndhF序列均來于GenBank數(shù)據(jù)庫，詳見表 2表 2表 23： 第二章 實(shí)驗(yàn)方法 15 表 21：菊屬 19 種。 K2P模型是 DNA條形碼研究中使用最多的距離參數(shù) , 也是生命條形碼聯(lián)盟推薦的距離計(jì)算模型( 基于 K2P模型應(yīng)用 MEGA UPGMA樹。 通過對 23 種紫草屬的遺傳相似性系數(shù)做進(jìn)一步的 UPGMA 聚類分析，可得出它們的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖 32 所示，從圖中可看出所有材料明顯分為兩組。 (3)序列長度適宜 , 比對比較容易 。而 ndhF 基因比其他葉綠體編碼基因具有更高的堿基替代速率，再加上進(jìn)化速率快和穩(wěn)定性好，以及方便快捷的優(yōu)勢，所以采用 ndhF 基因 DNA 序列研究 植物 遺傳關(guān)系是再好不過了，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也驗(yàn)證可這一點(diǎn)。結(jié) 論 23 結(jié) 論 1 DNA條形碼技術(shù)是遺傳分析非常有效的方式 利用合適的分子標(biāo)記技術(shù)，可以非常有效的解決傳統(tǒng)的植物分類中所存在的一些問題。鑒于此， DNA條形碼技術(shù)是遺傳關(guān)系分析非常有效的方式 。 導(dǎo)師的言傳身教、廣博的學(xué)識(shí)和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度將使我受益終生。同一種生物在不同的生長時(shí)期 DNA序列信息是相同的、統(tǒng)一的、唯一的 , 即使經(jīng)過其他特別的加工 , 形態(tài)學(xué)特征發(fā)生了部分變化 , 都不會(huì)太影響 DNA序列信息 , 與傳統(tǒng)方法比較 , 檢測樣本的范圍得到了增加 。而且基因序列更新比較快，不同植物有很多條基因序列，導(dǎo)致難于選擇。其中最被看好的是 rbcL基因和和 ndhF基因。 ndhF 作為植物候選 DNA 條形碼 , 具有以下優(yōu)勢 : (1)引物通用性能夠確保其在不同植物 3個(gè)屬 中的不同類群進(jìn)行 PCR擴(kuò)增 。 表 31：菊屬群種間遺傳距離 第三章 結(jié)果與討論 19 表 32：紫草屬群種間遺傳距離 表 33：狗尾草屬群種間遺傳距離 第三章 結(jié)果與討論 20 聚類分析 通過對 19 種菊屬的遺傳相似性系數(shù)做進(jìn)一步的 UPGMA 聚類分析，可得出它們的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖 31 所示，從圖中可看出所有材料明顯分為兩組。 采用 Clustal X (Thompson et al., 1997)在各個(gè)屬內(nèi)的物種間或同一物種的不同個(gè)間 (缺乏同屬種的數(shù)據(jù)時(shí) )進(jìn)行序列比對。我們從 NCBI數(shù)據(jù)庫中根據(jù)要分析的基因間序列尋找不同屬科植物的植物 DNA序列，根據(jù)課題題目我主要尋找了菊屬、紫草屬、狗尾草屬等植物科屬的一些序列片段，利用軟件和方法對這幾科植物進(jìn)行分析。 目前的研究 , 在整個(gè)生命世界 , 即使在整個(gè)植物界 , 找到一個(gè)基因或不太長的一個(gè) DNA片段來區(qū)別每一個(gè)物種幾乎是不可能的 , 但是通過一個(gè)條形碼組合在基因組范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)階層條形碼 , 逐級縮小范圍 , 最后達(dá)到物種自動(dòng)鑒定的目的是非?，F(xiàn)實(shí)和可行的，生物信息學(xué)家和網(wǎng)絡(luò)工程師利用分類學(xué)家建立的條形碼數(shù)據(jù)庫開發(fā)出物種自動(dòng)鑒定網(wǎng)絡(luò) 信息系統(tǒng) , 最終研制出便攜式的物種鑒定儀或 DNA barcoder裝備為大眾服務(wù)。 Chase et al.,2020。此外 , 隨著生物多樣性保護(hù)、藥品和食品市場規(guī)范以及資源調(diào)查等方面的社會(huì)需求日益增長 , 在選擇 DNA條形碼時(shí)還要考慮各種具體需求的特殊性 (2) 對類群進(jìn)行形態(tài)分類學(xué)修訂是開展植物 DNA條形碼研究的基礎(chǔ) , 而植物 DNA條形碼反過來可以檢驗(yàn)形態(tài)分類 , 但目前傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)和現(xiàn)代分子分類學(xué)還未能達(dá)到有機(jī)的結(jié)合。因 此 , DNA條形碼概念在 2020年一經(jīng)提出 , 就得到了科技界和社會(huì)的積極響應(yīng)。如果隨機(jī)分割所獲得的支持率高于鄰接分區(qū)則意味著這些分類群存在快速輻射進(jìn)化歷史 , 反之則是重組子對系統(tǒng)樹的干擾。有時(shí)足夠的序列數(shù)據(jù)可能依然無法得到理想的系統(tǒng)樹分支 , 主要表現(xiàn)為某些分類群在系統(tǒng)樹上始終為短枝 , 其枝長為 0或接近 0, 暗示了組成短枝的植物存在快速分化 ( rap id radiation, 也稱適應(yīng)性輻射進(jìn)化 ) , 即這些植物種在較短時(shí)間內(nèi)從祖先中分化出 , 在分子上的變異較小 , DNA序列上表現(xiàn)為同一核苷酸位點(diǎn)較第一章 引 言 11 短時(shí)間內(nèi)可能經(jīng)歷了多次突變 , 因此即使應(yīng)用足夠 的 DNA數(shù)據(jù)都無法解決其間的系統(tǒng)關(guān)系。 基因位點(diǎn)的譜系重排和植物的雜交、多倍化事件作為引起系統(tǒng)關(guān)系結(jié)果沖突的兩大原因是可以區(qū)分的。 (4) 基于葉綠體不同區(qū)域間的系統(tǒng)結(jié)果矛盾。 由常用 DNA 片段分析向低拷貝核基因分析發(fā)展 長期以來 , 基于 DNA序列分析的植物系統(tǒng)學(xué)研究依賴于 cpDNA和 nrDNA的重復(fù)區(qū) , 特別是內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) ( ITS) 的應(yīng)用最為頻繁。 DNA 序列分析技術(shù)能應(yīng)用于植物系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化研究中，該方法研究主要是通過提取植物的基因組 DNA, 設(shè)計(jì)引物并且擴(kuò)增出適合進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化研究的基因片段 ,進(jìn)行 測序之后進(jìn)行序列比對 , 建立取代模型然后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 , 用來分析物種間親緣關(guān)系和演化變異。 DNA 序列分析在植物分子系統(tǒng)學(xué)研究中的應(yīng)用和難題 分