【正文】 F 中的細菌 成份，真實的物種分布及豐度信息。diatrique of Bangui,Central African Republic[J].J Trop Pediatr,20xx,54(2):125 128. [9] Pomar V,Martinez S,Paredes R,et in adjuvant therapy against acuge bacterial meningitis[J].Curr Drug Targets Infect Disord,20xx,4(4):303309. [10] Kanegaye JT， Soliemanzadeh P， Bradley JS． Lumbar puncture in pediatric bacterial meningitis： Defining the time inteval for recovery of cerebrospinal fluid pathogens after parenteral antibiotic pretreatment[J].Pediatrics,20xx,108(5):11691174． [11] Greisen K,Loeffelholz M,Pumhit A,et primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bactera， including bacteria found in cerebrospinal fluid[J].J Clin Microbio,1994,32(2):335351. [12] Shang S,Chen Z,Yu of bacterial DNA by PCR and reverse hybridization in the 16S rRNA gene with particular referece to neonatal septicemia[J].Acta Paediatr,20xx,90 (2):179183. [13] Lu JT,Pemg CL,Lee SY,et of PCR with universal primers and restriction endonuclease digestions for detetion and identification of mon bacterial pathogens in cerebrospinal fluid[J].J Clin Microbiol,20xx,38(6):20762080． [14] 畢春霞，武靜，張德坤等 .腦脊液病原菌 16S rRNA 微型寡核苷酸芯片檢測方法的初步研究 [J].青島大學醫(yī)學報學報 ,20xx,42(3):200202. [15] Handelsman J,Rondon MR,Brady SF,et biological access to the chemistry of unknown soil microbes:a new frontier for natural products[J].Chem Biol,1998,5(10):245 249. [16] MacNeil IA,Tiong CL,Minor C,et al. Expression and isolation of antimicrobial small molecules from soil DNA libraries[J].J Mol Microbiol Biotechnol,20xx,3(2):301308. [17] Gill SR,Pop M,Deboy RT,et analysis of the human distal gut microbiome[J].Science,20xx,312(5778):13551359. [18] Breitbart M, Hewson I,Felts B,Mahaffy JM,Nulton J,Salamon P,Rohwer analyses of an uncultured viral munity from human feces[J].Bacteriol,20xx,185(20):6220 6223. [19] Walter J,Mangold M,Tannock ,analysis,and betaglucanase screening of a bacterial artificial chromosome library from thelargebowel microbiota of mice[J].Appl Environ ,71(5):23472354. [20] DiazTorres ML,Villedieu A,Hunt N,et the antibiotic resistance potential of the indigenous oral microbiota of humans using a metagenomic approach[J].FEMS Microbiol Lett,20xx,258(2):257262. [21] Manichanh C,RigottierGois L,Bonnaud E,et diversity of faecal microbiota in Crohn39。可變區(qū)在不同細菌之間存在有不同程度的差異，具有屬或種的特異性，可變區(qū)與保守區(qū)交錯排列。目前，人體液中常見病原菌的16S rDNA基因幾乎全部測序完成，為細菌的基因診斷提供了條件 ， 16S rDNA編碼基因的這些特點使之成為較理想的細菌基因分類的靶序列，逐漸成為細菌鑒別、分類的金標準。 BLAST 有多個結果的序列會根據(jù)眾數(shù)原則，也就是如果 66%的比對結果都支持同一個物種分類，那么就認為是屬于那個物種分類的。 不同階段 樣品 間的比較分析 基于系統(tǒng)進化，功能注釋的多樣品比較分析可尋找 細菌 分類上的顯著差異。所以測序和生物信息學分析是本研究的關鍵，本課題組將借助 深圳華大基因研究院生物信息中心 在基因組測序和生物信息學分析方面的強大優(yōu)勢來完成本課題的研究。 樣本的處理 從 80℃ 冰箱取出 CSF樣本，室溫解凍 ， 分別將每份 CSF混勻后， 于 Effendorf管中，采用差速離心法對樣本中的細菌進行富集。 16S rDNA 引物的選取與 PCR 擴增 本研究選擇 16S rDNA 基因通用引物： 27F(5’ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’ )和 1492R(5’ TACTTGTTACGACTT3’ )，進行 PCR 擴增。 測序 及分析 流程： （ 1）進行原始數(shù)據(jù)的處理： ① 去除有 adapter 污染的序列 ； ② 數(shù)據(jù)的拼接：運用華大研發(fā)的 overlap 拼接軟件對數(shù)據(jù)進行拼接，得到拼接的結果。最終產(chǎn)生的就是 V6 區(qū)的序列 。 （ 3） 細菌 分類：使用 BLASTN 將序列比對到 16S rDNA 數(shù)據(jù)庫。如果不符合要求，就向上一個 細菌 分類等級再做比對。是一個環(huán)境中物種的多樣性分析的結果。 （ 8） PCA 分析：基于 profiling table，找出不同環(huán)境中變化較大的 細菌 。 4 可行性分析 總體研究方案切實可行 從學術思路上看，宏基因組學以環(huán)境中全部 DNA 作為研究對象，通過克隆異源表達來篩選有用基因及其產(chǎn)物；是研究微生物生態(tài)是新型發(fā)展的方法。申請單位和協(xié)作單位都具備承擔相關技術的研究工作基礎，并得 到國內(nèi)同行的認可。深圳華大基因研究院生物信息中心先后完成了國際人類基因組計劃 “ 中國部分 ” （ 1%）、國際人類單體型圖計劃（ 10%）、水稻基因組計劃、家蠶基因組計劃、家雞基因組計劃、抗 SARS研究、炎黃一號等多項具有國際先進水平的科研工作，在《 Nature》和《 Science》等國際一流的雜志上發(fā)表多篇論文，其測序能力及基因組分析能力正在經(jīng)歷從亞洲第一到世界領先的歷史性跨越；開展了廣泛的國際國內(nèi)科技合作與交流；開發(fā)各種方法與計算工具進行數(shù)據(jù)分析，并構建具有友好用戶界面的數(shù)據(jù)庫以促進知識的傳播。 臨床應用可行 寧夏醫(yī)科大學附屬醫(yī)院是寧夏回族自治區(qū)規(guī)模最大、技術力量雄厚、醫(yī)療設備先進、專家人才薈萃的一所綜合性三級甲等醫(yī)院，醫(yī)院開放床位 20xx 張，神經(jīng)內(nèi)科擁有床位114 張，工作日門診量超過 150 人 /日。這將解決化膿性腦膜腦炎的病原學診斷困難 的 難題 ，并為 尋找 CSF 中細菌 的抗生素抗性基因 奠定基礎 。 （六） 研究基礎 1 與項目有關的前期工作積累 （ 1） 分子生物學研究基礎： 課題負責人作為主研人之一先后參加了日本資助的國際合作科研項目： “ 中國神經(jīng)精神病人病 BDV 感染的分子生物學研究 ” （由日本濱松醫(yī)科大學神經(jīng)精神科和福島醫(yī)科大學微生物教研室資助約 120 萬日元科研試劑、藥盒、 BDVMDCK 標準病毒株和其他實驗材料）和 20xx 年國家自然科學基金資助項目： “ 神經(jīng)精神疾病博爾納病病毒感染的分子流行病學研究 ” （編號： 30470605；經(jīng)費： 21 萬）的研究工作。1,2,3,4,5 為樣本 P24 基因片段 (1 為陰性 。 （ 3） 專利申報 課題負責人于 20xx 年 11 月主持申報專利 “ 博爾納病病毒巢式逆轉錄熒光定量聚合酶 鏈反應診斷試劑盒 ” ，申報單位為：寧夏醫(yī)學院附屬醫(yī)院、重慶醫(yī)科大學和中山大學達安基因診斷中心；已于 20xx 年 1 月 13 日由中華人民共和國國家知識產(chǎn)權局受理，申請?zhí)枺?。 （ 2） 寧夏醫(yī)科大學附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心分子生物實驗室：本實驗室已完全具有支持本課題的實驗室硬件條件。先后完成了國際人類基因組計劃 “ 中國部分 ” （ 1%）、國際人類單體型圖計劃（ 10%）、水稻基因組計劃、家蠶基因組計劃、家雞基因組計劃、抗 SARS 研究、炎黃一號等多項具有國際先進水平的科研工作，在《 Nature》和《 Science》等國際一流的雜志上發(fā)表多 篇論文，建立了大規(guī)模測序、生物信息、克隆、健康、農(nóng)業(yè)基因組、蛋白等技術平臺，其測序能力及基因組分析能力正在經(jīng)歷從亞洲第一到世界領先的歷史性跨越；開創(chuàng)了科學、技術、產(chǎn)業(yè)相互推動的發(fā)展模式；開展了廣泛的 國際國內(nèi)科技合作與交流；建設了一支具有世界一流水平、年輕的產(chǎn)學研隊伍；有 1000 多位來自不同研究背景的科研工作者，包括生物、物理、數(shù)學、醫(yī)學、計算機等。 項目負責人（簽章） 年 月 日 實驗室 學術委員會審查意見 （公章） 年 月 日 實驗室 意見 （公章） 年 月 日