【正文】 ................................................................15 第 三 章 結(jié)果與討論 ...........................................................................................16 溫度控制條件的確定 .................................................................................16 除雜前提取液吸收光譜的測定 .................................................................19 提取液處理前后的紫外光譜分析 .............................................................22 提取液的高效液相色譜譜圖分析 .............................................................24 除雜前后對有機(jī)玻璃的上色效果 .............................................................27 結(jié) 論 ..........................................................................................................................29 致 謝 ........................................................................................... 錯誤 !未定義書簽。 除雜的條件是， 3℃ 6 小時， 45℃ 60 分鐘， 20xx 轉(zhuǎn) /分 離心 15 分鐘 。 Impurity1 引 言 天然產(chǎn)物廣泛存在于多種生物特別是動植物體中，其安全性和營養(yǎng)價值高，有的兼有一定的藥理作用。其中主要包括蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、核酸、各種酶類、單糖、寡糖、多糖、糖蛋 白、樹脂、膠體物、木質(zhì)素、維生素、脂肪、油脂、蠟、生物堿、揮發(fā)油、黃酮、糖苷類、萜類、苯丙素類、有機(jī)酸、酚類、醌類、內(nèi)酯、甾體 化合物、鞣酸類、抗生素類等天然存在的化學(xué)成分，其中許多有效成分是預(yù)防和治療疾病、調(diào)節(jié)身體的物質(zhì)基礎(chǔ)。由于生物合成代謝的復(fù)雜 性 ， 許多天然物質(zhì)很難在人工控制下化學(xué)合成 ， 人工合成的方法只能生產(chǎn)極個別的具有天然 產(chǎn)物 化學(xué)組成和分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。 天然 產(chǎn)物 的提取方法 發(fā)展至今，天然 產(chǎn)物 的提取方法常見的有有機(jī)溶劑提取法、堿液提取法、超臨界提取法、微波萃取法等幾種方法。相對而言 ， 有機(jī)溶劑提取法萃取劑便宜 ， 設(shè)備簡單 ， 操作簡單易行 ， 提取率較高 ， 但用其提取的某些產(chǎn)品質(zhì)量較差 ， 純度較低 ， 有異味或溶劑殘留 ，影響產(chǎn)品的應(yīng)用范圍。由于堿提法加工過程需消耗大量酸堿 ， 且廢液較難回收 ， 因此近幾年來對堿提法的研究報道較少。 Tsunc 等的專利報道中 ， 應(yīng)用超臨界 2CO 從蝦殼中提取蝦青素 ， 濃度可達(dá)到 %[9]。 (5)分子蒸餾技術(shù) 分子蒸餾是一種特殊的液 液分 離技術(shù) ， 其基本原理是基于不同物質(zhì)分子在高真空下分子運(yùn)動平均自由程的差別 ， 在遠(yuǎn)低于物質(zhì)常壓沸點(diǎn)溫度的條件下將其分離出來。 (6)雙水相萃取技術(shù) (ATPE) 雙水相萃取技術(shù)是二十世紀(jì) 60 年代以來研究開發(fā)的新型固 液分離技術(shù)。該技術(shù)具有分離效率高 ，分析速度快 ， 用樣量少 ， 靈敏度高 ， 流出組分可收集 ， 兼具分析和制備等優(yōu)點(diǎn) ， 適應(yīng)于高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性差的化合 物的分離分析。應(yīng)用纖維素酶提取紅花中的紅花黃色素 ， 與傳統(tǒng)水浸提取工藝相比 ， 提取率提高了%%， 具有提取條件溫和 ， 有效成分理化性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。該法工藝簡單 ，效能高 [11]。云南的西雙版納、武陵山區(qū)、秦巴山及東北的長白山為天然色素植物資源較為集中的地區(qū) ， 玉米、紅花、辣椒等品種為我國發(fā)展天然色素工業(yè)提供了充足的原料。目前 ， 我國已推出品種繁多的天然食用色素 ， 諸如 ， 姜黃色素、葉綠素銅鈉鹽、紅藥子黃色素、玉米黃色 素、紅曲色素粉、高粱紅色素、棗紅色素、桅子黃色素、辣椒紅色素、紅花黃色素等 ， 均受到廣大食品廠家的青睞。焦糖色素是一種天然的食品著色劑和天然食用色素。中 國天然 產(chǎn)物 的發(fā)展將為我國進(jìn)人一日三餐的加工食品增加更多的色彩和安全感。 我國天然 產(chǎn)物 的發(fā)展方針 我國天然 產(chǎn)物 產(chǎn)業(yè)是改革開放以來 ， 隨著食品工業(yè)的蓬勃發(fā)展而發(fā)展壯大起來的。我國天 然色素資源豐富 ， 進(jìn)一步開發(fā)、研究、生產(chǎn)、應(yīng)用功能性天然色素大有潛力。采用了高新技術(shù) ， 就是提高設(shè)備的裝備水平 ， 這是提高天然色素的收率 ， 提高產(chǎn)7 量 ， 保證優(yōu)質(zhì)的基礎(chǔ)。多數(shù)工廠所生產(chǎn)的是原料型的天然色素 ， 一般不能直接使用 ， 因而價格低 ， 經(jīng)濟(jì)效益不高。在天然色素的發(fā)展方面 ， 應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步加強(qiáng)天然色素實(shí)用技術(shù)的研究、開發(fā) ， 這個課題并不亞于天然色素本身的研究、開發(fā)和生產(chǎn) ， 是我國天然色素打開國內(nèi)外市場的關(guān)鍵。目前許多天然紅色素 ， 如紅高粱、酸棗色、葡萄皮紅等 ， 都是從農(nóng)產(chǎn)品的廢棄物中提取的。一個姜黃原料可以生產(chǎn)出姜黃油、姜黃素、姜黃油樹脂、姜黃粉、乳化姜黃色素等多種產(chǎn)品 ， 這對于農(nóng)產(chǎn) 品的深加工以及廢棄物的處理 ， 不失為一個好方法。一些外國的有識之士也十分重視這個市場。 蛋白質(zhì)分離純化 方法 (1)根據(jù)分子大小不同進(jìn)行分離純化 蛋白質(zhì)是一種 大分子物質(zhì) ， 并且不同蛋白質(zhì)的分子大小不同 ， 因此可以利用一些較簡單的方法使蛋白質(zhì)和小分子物質(zhì)分開 ， 并使蛋白質(zhì)混合物也得到分離。超濾是利用離心力或壓力強(qiáng)行使水和其它小分子通過半透膜 ， 而蛋白質(zhì)被截留在半透膜上的過程。所以在使用超濾方法時要選擇合適的濾膜 ， 也可以選擇切向流過濾得到更理想的效果。 使蛋白質(zhì)在具有密度梯度的介質(zhì)中離心的方法稱為密度梯度 (區(qū)帶 )離心。蔣辰等通過比較不同密度梯度介質(zhì)的分離效果 ， 利用溴化鈉密度梯度得到了高純度的蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白。在甘露糖蛋白提純的過程中使用凝膠過濾方法可以得到很好的效果 ， 純度鑒定證明產(chǎn)品為分子量約為 32kDa、成分是多糖 ∶ 蛋白質(zhì) (88∶ 12)、多糖為甘露糖的單一均勻糖蛋白 [14]。常用的方法有等電點(diǎn)沉淀和 pH 值調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析、有機(jī)溶劑法、雙水相萃取法、反膠團(tuán)萃取法等。王洪新等 [15]研究茶葉蛋白質(zhì)提取過程發(fā)現(xiàn) ， pH 值為 4 時茶葉蛋白提取效果最好 ， 提取率達(dá)到 %， 初步純化得率為 %。他們利用堿溶法提取葡萄籽蛋白質(zhì) ， 得到了最佳的提取工藝為 ： 以 511 10 mol L????的 NaOH溶液 ， 按 1∶ 5 的料液比 ， 在 40℃ 攪拌 40 min， 葡萄籽蛋 白質(zhì)提取率達(dá) %。應(yīng)當(dāng)指出 ， 同樣濃度的二價離子中性鹽 ， 如 2MgCl 、4 2 4()NH SO 對蛋白質(zhì)溶解度影響的效果 ， 要比一價離子中性鹽如 NaCl 、 4NHCl 大得多。為防止不同分子之間產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象 ， 蛋白質(zhì)樣品的含量一般控制在 %～ %。由于在室溫下 ， 有機(jī)溶劑不僅能引起蛋白質(zhì)的沉淀 ， 而且伴隨著變性。冷乙醇法也是目前 WHO 規(guī) 程和中國生物制品規(guī)程推薦的方法 ， 不僅分辨率高、提純效果好、可同時分離多種血漿成分 ， 而且有抑菌、清除和滅病毒的作用。對于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì) ， 需要先對細(xì)胞進(jìn)行有效破碎。反膠團(tuán)是當(dāng)表面活性劑在非極性有機(jī)溶劑溶解時自發(fā)聚集而形成的一種納米尺寸的聚集體。 在外電場的作用下 ， 帶電顆粒 (如不處于等電點(diǎn)狀態(tài)的蛋白質(zhì)分子 )將向著 與其電性相11 反的電極移動 ， 這種現(xiàn)象稱為電泳。利用等電聚焦技術(shù)分離蛋白質(zhì)混合物是在具有 pH 梯度的介質(zhì)中進(jìn)行的。 離子交換層析 (Ion exchange chromatography ， IEC)是以離子交換劑為固定相 ， 依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的 pH 值條件下 ， 其帶電狀況也 不同。另外 ， 離子交換層析還用于抗凝血蛋白的提取。近年來 ， 親和層析技術(shù)被廣泛應(yīng)用于靶標(biāo)蛋白尤其是疫苗的分離純化 ，特別是在融合蛋白的分離純化上 ， 親和層析更是起到了舉足輕重的作用 ， 因為融合蛋白具有特異性結(jié)合能力 [19]。 12 冷凍脫脂的原理及影響因素 冷凍脫脂原理 天然 脂 類 中不同類型的甘三酯的熔點(diǎn)有一定的差異 ， 隨著溫度的降低固體脂 在有機(jī)溶劑中的 溶度降低 ， 因此通過 降溫 冷卻能促使固體脂結(jié)晶 ， 然后進(jìn)行固液分離即可達(dá)到脫脂的目的 。某種油脂最穩(wěn)定晶型的獲 得是由冷卻速度和結(jié)晶溫度決定的 ， 溫差過大的急驟冷卻易形成無法分離的玻璃質(zhì)體 ， 只有緩慢冷卻至一定的結(jié)晶溫度 ， 才能獲得相應(yīng)的晶型 ， 冷卻速率取決于冷卻介質(zhì)與油脂的溫差和傳熱面積。三是攪拌速度。 四 是 溶液品質(zhì)。離心分離生物分子是最常用的生化分離方法，因為不同的生物分子有不同的體積和密度，可在不同離心力的作用下沉降分離。 離心分離的基本原理 當(dāng)非均相體系圍繞一 中心軸做旋轉(zhuǎn)運(yùn)動時，運(yùn)動物體會受到離心力的作用，旋轉(zhuǎn)速率越高，運(yùn)動物體所受到的離心力越大。 常用 離心方法 根據(jù)離心方式的不同，可分為差速離心法和密度梯度離心等。 (2)密度梯度離心：也叫區(qū)帶離心，即離心是在具有連續(xù)密度梯度的介質(zhì)中進(jìn)行。 15 實(shí)驗方法 粗提取液 純化 (1)冷凍脫脂 分別取迎春花、連翹花粗取液各 50ml 于兩個燒杯中，貼上標(biāo)簽置于冰箱中按設(shè)定溫度 3℃ 進(jìn)行低溫處理 ， 低溫處理完成以 20xx minr 轉(zhuǎn)速高速離心得到除去脂肪后的提取液，分別將離心后所得提取 液與固體殘渣分離，觀察處理后的提取液的色澤及澄清度，取適量上層清液用紫外分光光度計測其在 190nm900nm 波長范圍內(nèi)的光譜 。 回歸方程為： Y=A+exp(x/t1)+Y0 （ 31） 0 1 2 3 4 5 6246810121416182022Temperauure/℃Tim e /h 圖 水的降溫曲線 A= t1= Y0= 17 0 30 60 90 120 15020304050Temperatuer/℃Tim e /m in 圖 水 45℃ 升溫曲線 A= t1= Y0= 根據(jù)上述分析的結(jié)果，確定控溫溫度與要求溫度的差為 2℃ 。 迎春花和連翹花樣品實(shí)物圖見圖 和圖 。 提取液處理前后的紫外光譜分析 處理后的樣品 光譜見圖 。 100 200 300 400 500 600 700 800 900020406080100T%w a v e l e n g t h (n m ) 原液空白 處理后 圖 迎春花對有機(jī)玻璃上色紫外光譜圖 28 100 200 300 400 500 600 700 800 900020406080100T%w a v e l e n g t h (n m ) 空白 原液 處理后 圖 連翹花對有機(jī)玻璃上色紫外光譜圖 從圖 中可以看出，除雜后染色效果 加 強(qiáng) 。 提取液吸光度的表征可 知 ：經(jīng)除雜后的提取液光譜強(qiáng)大有較大的增強(qiáng)，提取液純度有較好的