【正文】 (K) 可在 B中生存，是因 B對 λ(K) 進行了修飾。第二章 基因工程中常用的工具酶基因工程的基本流程TOOLS FOR GENE CLONINGSCISSORS: RESTRICTION ENZYMES GLUE: DNA LIGASE VEHICLE: PLASMID OR VIRAL VECTORS第二章 E. coliλ 噬菌體的限制修飾模式 ? ? 噬菌體在感染某一宿主后，再去感染其它宿主時會受到限制。② Dcm甲基化酶 在 CCAGG序列的第 2個 胞嘧啶 C5位引入甲基。3. 限制性核酸內切酶的發(fā)現? 到 1986 年下半年，發(fā)現 615 種限制酶和 98 種甲基化酶。n 限制酶裂解 DNA雙鏈的磷酸二酯鍵n 酶切得到 5`P和3`OH一、限制性內切酶的發(fā)現二、限制性內切酶的定義三、限制性內切酶的命名四、限制性內切酶的分類五、 II型限制內切酶的基本特性六、影響酶活性的因素七、限制內切酶的用途 第一節(jié) 限制性核酸內切酶與 DNA分子的體外切割三、限制性核酸內切酶的命名① 第 1個字母大寫，表示來源物種屬名的第一個字母。Eco RI： Escherichia coli R⑤ 若從一種細菌中分離出幾種不同的酶，則根據發(fā)現順序用羅馬數字表示。在已純化分類的 3000種限制性內切酶中，已發(fā)現了超過 250種的特異識別序列。這些酶的大小居中，約為 400650個氨基酸左右；它們識別 連續(xù) 的 非對稱序列 ，有一個結合識別位點的域 和一個專門 切割 DNA的 功能域 。有些酶識別 連續(xù)序列 ，并在識別位點的一端切開 DNA鏈；而另一些酶識別不連續(xù)的序列 (如 BcgI： CGANNNNNNTGC)，并在識別位點的兩端切開 DNA鏈，產生一小段含識別序列的片段。致，具有高度特異性 : Mg 2+ II型限制性內切酶的特點五、 II型限制性核酸內切酶的基本特性（ 1）限制酶識別序列的長度 限制性內切酶在雙鏈 DNA上能夠識別的 特殊核苷酸序列被稱為 識別序列 。 （ 5）限制酶切后產生兩個末端，末端結構是５ ’ Ｐ和３ ’ ＯＨ4．末端種類 (切割方式 )（ 1） 5’ 黏性末端和 3’ 黏性末端 （ cohesive end） 識別位點為回文對稱結構的序列經限制酶切割后，產生的末端為黏性末端，這樣形成的兩個末端是相同的，也是互補的。n 同一個 DNA分子內連接： 通過兩個相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。粘性末端的意義部分常用的限制性內切酶（ 3）非互補黏性末端 (不對稱末端 )當識別序列為非對稱序列時，切割的 DNA 產物的末端是不同的。 CCCGAG。KpnI GGTAC C Asp718 G GTACC SstI CCGC GG SacI CCGC GG 有一些 來源不同 的限制性酶識別的是 相同的核苷酸靶序列 ，這類酶稱為同裂酶。* 現已研究發(fā)現，許多動物 DNA中 90%以上的甲基，都是在序列 CG處以 5甲基胞嘧啶的形式出現。216。 3180。 3180。 3180。167。五、 II型限制性核酸內切酶的基本特性? 另外一些不常見的酶識別位點相對較長，在 DNA鏈上出現頻率也相對較低。?真核生物中， DNA中的 CG:GC=1:3，這也影響酶切位點的出現頻率。 酶的純度216。 DNA分子的結構216。? DNA的甲基化 1. 原核生物的限制 修飾系統的組成成分是： 甲基化酶：對自身 DNA起修飾作用，從而使限 制性內切核酸酶不能識別，保護自 身 DNA免受降解。而要解除這種限制修飾作用通常有兩種方法： ① 選用上述酶的同功酶，如 Sau3AI， DNA識別切割位點與 MboI相同；但不受甲基化影響；? DNA的甲基化 ? 解除限制修飾作用的方法： ② 利用甲基化酶缺失的受體細胞進行 DNA的制備，如 E. coli JM110和鏈霉菌等，前者 Dam和 Dcm甲基化酶已敲除，而后者細胞內本就沒有甲基化酶，從這些細胞中抽提的 DNA就能被上述酶切割。酶 反應溫度（ ℃ ）ApaⅠBanⅠBstEⅡMaeⅠMaeⅡMaeⅢSmaⅠTaqⅠ3050604550552565部分限制性內切核酸酶的最適反應溫度? DNA分子結構 DNA分子的不同的構型對限制性內切核酸酶的活性也有很大的影響。? DNA分子結構近末端的切割： eg: AccI GGTCGACC? DNA分子結構一般來說，一種限制性內切核酸酶對其不同識別位點切割速率的差別最多不會超過 10倍 。 ? DNA分子結構? 限制性核酸內切酶的反應緩沖液1. 緩沖液的主要成分TrisCl： 使反應混合物的 pH恒定在酶活性所要 求的 最佳數值 范圍內。35β 巰基乙醇： 防止限制酶的氧化，保持酶的穩(wěn)定性 （但也可能有利于潛在污染雜質的穩(wěn)定 性）。① 概念實際上星號活性是限制性內切酶的一般性質，任何一種限制酶在極端非標準條件下都能切割非典型位點。 8: 無 NaCl。 限制酶（物理）圖譜繪制216。n 部分酶切的方法： 縮短保溫時間、降低反應溫度、減少酶的用量。也稱 DNA物理圖譜。后變性后轉移到尼龍膜或硝酸纖維膜，然后與同位素標記的探針雜交，最后做放射自顯影，檢測多態(tài)性條帶。三月 2120:41:5820:41Mar2111Mar21n 1故人江海 別 ，幾度隔山川。 。 三月 21三月 21Thursday, March 11, 2023n 很多事情努力了未必有 結 果，但是不努力卻什么改 變 也沒有。 三月 21三月 2120:41:5820:41:58March 11, 2023n 1意志 堅 強 的人能把世界放在手中像泥 塊 一 樣 任意揉捏。2023/3/11 20:41:5820:41:5811 March 2023n 1空山新雨后，天氣晚來秋。 三月 2120:41:5820:41Mar2111Mar21n 1越是無能的人，越喜 歡 挑剔 別 人的 錯 兒。 11 三月 20238:41:58 下午 20:41:58三月 21n 1最具挑 戰(zhàn) 性的挑 戰(zhàn) 莫 過 于提升自我。POWERPOINTLorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Fusce id urna blandit, eleifend nulla ac, fringilla purus. Nulla iaculis tempor felis ut cursus. 感謝您的下載觀看專 家告 訴