【正文】 淀過(guò)夜或70℃沉淀1h以上。（4）標(biāo)記核酸的保存：真空干燥或室溫風(fēng)干標(biāo)記沉淀物， mmol/L EDTA溶液或滅菌雙蒸水中。（2）核酸純度：由于光敏生物素能與任何有機(jī)物反應(yīng)，因此用做標(biāo)記探針的核酸要高度純化。一般認(rèn)為，每100～400bp標(biāo)記上一個(gè)光敏生物素分子。二、原位雜交原位雜交（in situ hybridization）用特定標(biāo)記的已知堿基序列核酸作為探針與組織、細(xì)胞中待檢測(cè)核酸按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則在原位進(jìn)行特異性結(jié)合，形成雜交體，然后用與標(biāo)記物相應(yīng)的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)免疫組織化學(xué)方法在被檢測(cè)核酸原位進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)核酸定位。(一)取材與標(biāo)本固定1． 取材　對(duì)于原位雜交所用的材料要盡可能新鮮，為了防止RNA的降解，取材要迅速，取材后要盡快固定或冷凍保存。4． 固定方法　組織標(biāo)本取材后，迅速放入固定液中2～4h，取材組織大小為1cm1cm，不宜太大。在160℃烤箱中烘烤2～4h。（2）石蠟切片：組織固定后，常規(guī)石蠟包埋切片，可長(zhǎng)期保存，隨時(shí)用于原位雜交。(三)試劑配制配制溶液過(guò)程中均需戴手套，液體配制均用超凈水，所用瓶子均經(jīng)160℃烘烤4h，主要目的是去除RNA酶。A液：B液＝∶ ％。5． 緩沖液（1） 緩沖液Ⅰ(pH )　為1mol TrisHCl 100ml；5mol NaCl 20ml；消毒超凈水加至1000ml。7． 50％硫酸葡聚糖　5g硫酸葡聚糖加10ml DEPC水，不斷攪動(dòng)使之完全溶解。(四)雜交與顯色1．雜交　將已標(biāo)記的探針加入預(yù)雜交液即成為雜交液（探針濃度為1μg/m1），切片經(jīng)2SSC短暫浸洗后，滴加雜交液，于濕盒內(nèi)置37℃或42℃孵育過(guò)夜。（1）緩沖液I洗1min。（5）緩沖液I洗10min。（8）常規(guī)脫水、透明、封固。如省去標(biāo)記探針仍出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，這一定是假陽(yáng)性。陰性對(duì)照可排除在雜交過(guò)程中由于非特異性雜交反應(yīng)等因素造成的假陽(yáng)性結(jié)果。故若預(yù)期雜交結(jié)果為陰性時(shí)，就必須設(shè)陽(yáng)性對(duì)照，當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照亦不顯色，就證明雜交過(guò)程的某一步驟或所用試劑問(wèn)題。 PCR反應(yīng)理論的提出和技術(shù)的完善對(duì)于分子生物學(xué)的發(fā)展具有特殊的意義，它以敏感度高、特異性強(qiáng)、產(chǎn)率高、重復(fù)性好以及快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)迅速成為分子生物學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的方法之一，并使得很多以往無(wú)法解決的分子生物學(xué)研究難題得以解決。末端互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物（primer），在耐熱DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)制沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA分子合成。上述三個(gè)步驟構(gòu)成一個(gè)循環(huán)，新合成的DNA分子繼續(xù)作為下一輪合成的模板，經(jīng)多次循環(huán)（25～30次）后即可達(dá)到擴(kuò)增DNA片段的目的。然而如果不遵守引物設(shè)計(jì)的基本規(guī)則，即使改變反應(yīng)條件也不會(huì)有什么好效果。以下是引物設(shè)計(jì)的幾項(xiàng)基本原則。引物過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使退火過(guò)程不完全，與模板結(jié)合不充分，以至引起擴(kuò)增產(chǎn)物的明顯減少。端的第一和第二個(gè)堿基影響Taq DNA聚合酶的延伸效率，因而會(huì)影響PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率及特異性。對(duì)于引物539。因此可在引物539。一對(duì)引物之間可能存在互補(bǔ)序列，特別是339。G＋C含量50%的20個(gè)堿基寡核苷酸鏈的Tm值約在56℃～62℃范圍內(nèi)。若是以cDNA為模板，則首先應(yīng)盡力使引物和產(chǎn)物保持在mRNA的編碼區(qū)域內(nèi)。②退火（Annealing）：人工合成的兩條寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度下分別與模板DNA擴(kuò)增區(qū)域的兩端按堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，此時(shí)，DNA聚合酶便可開(kāi)始合成新鏈?！?39。在最初的循環(huán)階段，原來(lái)的DNA鏈起著模板的作用，隨著循環(huán)次數(shù)增加，新合成的引物延伸鏈急劇增多而成為主要模板，因此PCR擴(kuò)增產(chǎn)物將受到所加引物539。以下主要從反應(yīng)的特異性、敏感性、忠實(shí)性及擴(kuò)增效率等四個(gè)方面討論P(yáng)CR反應(yīng)條件的優(yōu)化。②退火：引物與模板的退火溫度由引物的長(zhǎng)度及G＋C含量決定。③延伸：延伸溫度取決于所用耐熱DNA聚合酶的最適溫度，通常為70℃～75℃，一般不隨意更改。④循環(huán)次數(shù)：主要取決于模板DNA濃度，一般為25～35次，此時(shí)PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值。具體方法是：先將PCR反應(yīng)體系升溫至95℃，預(yù)變性2～5 min后，將儀器設(shè)在暫停，在這一高溫條件下迅速加入耐熱DNA聚合酶后再恢復(fù)循環(huán)。2. 基因的體外突變　利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外對(duì)目的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。因此，PCR在基因診斷方面具有極廣闊的應(yīng)用價(jià)值。利用PCR與一些技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測(cè)的敏感性。即首先以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA，然后再以cDNA為模板通過(guò)PCR反應(yīng)來(lái)擴(kuò)增目的基因。3. 實(shí)時(shí)PCR技術(shù)　實(shí)時(shí)PCR（real time PCR）技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的一種新的核酸微量分析技術(shù)，尤其是在定量RTPCR中具有重要的價(jià)值。與傳統(tǒng)PCR反應(yīng)相比，在常規(guī)的正向和反向PCR引物之間增加了一對(duì)特殊的引物作為探針，探針的539。隨著PCR的進(jìn)行，Taq DNA聚合酶在鏈延伸過(guò)程中遇到與模板結(jié)合著的熒光探針，其5′→3′外切核酸酶活性就會(huì)將該探針逐步切斷，報(bào)告熒光基團(tuán)一旦與淬滅基團(tuán)分離，便產(chǎn)生熒光信號(hào)。 一、目的基因的獲得目的基因是指所要研究或應(yīng)用的基因，也就是將要克隆或表達(dá)的基因。2. 從真核基因組中制備　真核基因組比較大，直接用限制性?xún)?nèi)切酶消化后需要篩選的克隆數(shù)太多，不易操作。這樣一步步走下去，最終可得全部基因序列，這種技術(shù)叫做染色體步移（chromosome walking）。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是可以將表達(dá)水平很低的mRNA擴(kuò)增出來(lái)，有利于篩選出表達(dá)豐度低的基因。（三）基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和篩選將基因組DNA用限制性?xún)?nèi)切酶消化后插入到適當(dāng)載體中，得到含有不同插入片段的克隆載體，這種克隆載體的混合物含有長(zhǎng)短不同的基因組片段，這就是基因文庫(kù)?；蚪M文庫(kù)或cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和使用請(qǐng)參見(jiàn)本書(shū)相應(yīng)的章節(jié)?！　《⒛康幕蚝洼d體的連接獲得目的基因后必須將其放在一定的載體內(nèi)才能在宿主細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增或表達(dá)。無(wú)論研究的起始材料是RNA還是DNA，最重要的是要有一種有效的方法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆。設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)必須考慮以下幾個(gè)因素：①如果PCR產(chǎn)物序列未知，那么在引物上所提供的位點(diǎn)有可能會(huì)出現(xiàn)在產(chǎn)物DNA中，使用這些位點(diǎn)進(jìn)行酶切時(shí)將會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物內(nèi)部切割，產(chǎn)生缺失的克隆。突出端的線性化載體與帶有單個(gè)腺苷酸（A）339。對(duì)于多數(shù)DNA聚合酶，這個(gè)添加上去的核苷酸通常是A殘基。T突出端的載體，一種是將一個(gè)T殘基加到經(jīng)過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶線性化處理后產(chǎn)生平端的載體上，或者利用末端轉(zhuǎn)移酶加上一個(gè)雙脫氧胸腺嘧啶三磷酸（ddTTP）；另一種方法則是利用Taq DNA聚合酶具有的延伸酶活性，將一個(gè)A殘基加到DNA模板的339。只能加上一個(gè)T殘基。為了減少和防止這種情況的發(fā)生，需用高濃度的外源DNA（插入片段與載體的比率一般為3:1），并用堿性磷酸酶將載體上的539。（2）雙酶切的黏性末端間的連接：用兩種限制性?xún)?nèi)切酶消化載體和外源DNA片段，因黏性末端不同，載體分子和外源DNA片段只能按一種方向連接，這就是所謂“定向克隆”?！　∪⒅亟M分子的擴(kuò)增和鑒定（一）重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞目的基因和載體在體外連接形成重組DNA分子后，需要被導(dǎo)入受體細(xì)胞中才能進(jìn)行增殖和（或）表達(dá)。受體細(xì)胞是重組基因增殖的場(chǎng)所，所以對(duì)受體細(xì)胞也應(yīng)具有幾點(diǎn)要求：①容易接納重組DNA分子；②對(duì)載體的復(fù)制擴(kuò)增無(wú)嚴(yán)格限制；③不存在特異的能降解外源DNA的內(nèi)切酶體；④不對(duì)外源DNA進(jìn)行修飾。將重組DNA分子和感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞相混合，使重組DNA分子進(jìn)入大腸桿菌中，就可以實(shí)現(xiàn)重組DNA分子的轉(zhuǎn)化。但這種篩選并不能說(shuō)明目的基因一定連接到了載體上。根據(jù)這種特性，可以基本判斷重組成功與否。有關(guān)DNA序列分析技術(shù)將在有關(guān)章節(jié)詳細(xì)