【正文】 通用性文件或管理辦法，SOP（standard operating procedure）包括生產(chǎn)操作、輔助操作以及管理操作規(guī)程。（或工作方法）及程序。三、責(zé) 任 者：生產(chǎn)車間活疫苗細胞制備人員。 在操作前對所準備的各種用品進行全面的檢查核對。方法（2） 選擇12~13日齡發(fā)育良好的SPF雞胚，先用碘酒棉消毒蛋殼氣室部位，再用酒精棉脫碘，無菌取出雞胚，放滅菌的燒杯中，用漢克氏液洗滌胚體，再用滅菌的鑷子將胚夾入另一個放磁棒的滅菌三角瓶中，加37℃%胰酶溶液(每個雞胚8－10ml)，放在磁力攪拌器上以低速攪拌消化約20－25分鐘，取出加入適量含血清的漢克氏液中止消化。 地鼠或乳兔腎細胞單層的制備（用于牛、羊偽狂犬病疫苗）選10－20日齡地鼠或乳兔，放血致死后，無菌采取腎臟，將其皮質(zhì)部組織剪成１－２mm小塊，用漢克氏液洗2－3次后，按組織重量的5倍，%胰酶漢克氏液（－），置36－37℃水浴消化30－40分鐘，除去胰酶溶液后，用細胞生長液制成每1ml含60－80萬細胞的懸液。三 病毒的細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)是培養(yǎng)病毒最常用的技術(shù)，可用原代細胞、二倍體細胞或傳代細胞系，一般作靜止或旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。組織培養(yǎng)（tissueculture）和細胞培養(yǎng)（cell culture）在此領(lǐng)域基本是同義詞前者包括后者。此種細胞數(shù)量可擴大，對病毒的易感性則基本無變化，例如培養(yǎng)豬瘟用的犢牛睪丸細胞、豬傳染性胃腸炎用的乳豬腎細胞3 傳代細胞系（establishell cell line）與上述兩類細胞不同，這類細胞在傳代過程中染色體發(fā)生異常變異，在體外可無限制分裂的異倍體癌變細胞 優(yōu)點：傳代及培養(yǎng)方便，可節(jié)約元材料，因此使用廣泛缺點：1有的對分離的野毒不敏感 2實驗室傳代日久，可能污染支原體、霉形體、或隱性感染病毒。 2旋轉(zhuǎn)培養(yǎng) 將細胞液接入轉(zhuǎn)瓶后放于恒溫箱的轉(zhuǎn)瓶機上，轉(zhuǎn)數(shù)一般為1012轉(zhuǎn)/h 3懸浮培養(yǎng)是通過振蕩或轉(zhuǎn)動裝置使細胞始終處于分散懸浮于細胞培養(yǎng)液內(nèi)的方法，主要用于一些在振蕩或攪拌下能生長繁殖的細胞，如生產(chǎn)但克隆抗體的雜交瘤細胞。消化好的組織塊去掉胰酶經(jīng)吹打成分散的細胞，用于培養(yǎng)。某些半懸浮培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)的細胞如SP2/0瘤細胞，不需要消化，采用機械吹打即可形成單細胞。 為保持細胞最大活率，一般采用慢凍快融法。通常將從液氮中取出的細胞管置３７－４０℃水?。矗埃叮皊融化，離心后除去凍存液，然后將細胞懸浮于培養(yǎng)液中培養(yǎng)。（五）細胞培養(yǎng)要素1培養(yǎng)液 以往多用天然培養(yǎng)液，現(xiàn)多用合成培養(yǎng)液。2血清 在細胞培養(yǎng)液中必須添加一定量的血清方能獲得成功。糖蛋白、α２球蛋白和β脂蛋白G２能促進細胞貼壁。目前國內(nèi)多用犢牛血清，使用前須經(jīng)５６℃滅活３０ min，并進行細胞毒性試驗。最好盡可能不加入血清以維持細胞活力，并避免血清對病毒增殖的抑制作用。血清替代因子有激素和生長因子（如胰島素、上皮生長因子）、結(jié)合蛋白（如轉(zhuǎn)鐵蛋白）、貼壁因子（如魚精蛋白、聚賴氨酸）和微量元素（如硒）4類幾十種，其中有些是主要而且必需的，有些為輔助作用因子。一般為雞胚成纖維細胞為１００萬／ml，小鼠或地鼠腎細胞為50萬/ml，猴腎細胞量為30萬/ml，傳代細胞為10－30萬/ml。必要時可使加入氫離子緩沖劑HEPES（１０－１５mmol/L）以增加培養(yǎng)液的緩潰能力。（六）細胞培養(yǎng)的污污染染問題 細胞培養(yǎng)污染是指在細胞培養(yǎng)過程中，有害的成分或異物混入細胞培養(yǎng)環(huán)境中，包括微生物（細菌、真菌、支原體、病毒和原蟲等）、化學(xué)物和異種細胞等。應(yīng)用抗生素預(yù)防或處理污染細胞有一定效果。真菌污染時可用兩性霉素或制霉菌素處理，但效果不理想。 檢測支原體污染的方法很多，如相差顯微鏡法、熒光染色法和電鏡觀察法等。４． 病毒污染 病毒污染是指細胞培養(yǎng)中出現(xiàn)非目的的病毒。主要是在病毒污染實驗室中，培養(yǎng)液配制過程中受到污染。因此主要以預(yù)防為主，如選擇SPF動物組織、營養(yǎng)液配制用水和器皿應(yīng)消毒后使用等。（七）病毒增殖技術(shù)１．細胞的選擇　　　病毒須在敏感的宿主細胞中增殖，病毒培養(yǎng)的宿主一般選擇相應(yīng)易感動物的細胞。表43 常見病毒細胞感染譜病毒敏感細胞口蹄疫病毒狂犬病病毒偽狂犬病病毒日本乙型腦炎病毒豬瘟病毒豬水泡病病毒豬傳染性胃腸炎病毒豬繁殖與呼吸綜合征病毒豬圓環(huán)病毒豬細小病毒豬腦心肌炎病毒牛病毒性腹瀉黏膜病病毒牛流行熱病毒牛傳染性鼻氣管炎病毒馬傳染性貧血病毒雞傳染性喉氣管炎病毒雞痘病毒雞傳染性法氏囊病病毒雞馬立克氏病病毒鴨瘟病毒小鵝瘟病毒兔黏液瘤病毒犬瘟熱病毒犬傳染性腸胃炎病毒犬傳染性肝炎病毒犬細小病毒犬副流病毒貓泛白細胞減少癥病毒水貂傳染性腸炎病毒水貂阿留申病毒ＢＨＫ2ＰＫ1ＩＢＲＳ21細胞，牛、豬、羊腎原代細胞ＢＨＫ2Ｗ126細胞，雞胚成纖維細胞豬、兔腎原代細胞，雞胚成纖維細胞、ＢＨＫ21雞胚成纖維細胞、倉鼠腎細胞ＰＫ15細胞、豬腎細胞ＰＫ15細胞、ＩＢＲＳ21細胞，豬腎細胞豬腎、豬甲狀腺細胞，唾液腺細胞Ｍarc14ＣＬ2621，豬肺泡巨噬細胞ＰＫ15細胞ＳＴ細胞、豬腎細胞鼠胚成纖維細胞（FMF）、ＢＨＫ21細胞牛腎細胞、牛睪丸細胞牛腎、睪丸細胞，ＢＨＫ2Ｖero細胞牛睪丸細胞、豬腎細胞、ＨeＬa細胞驢、馬白細胞雞胚腎細胞雞胚成纖維細胞、雞胚腎細胞雞胚成纖維細胞雞、鴨胚成纖維細胞雞、鴨、鵝胚成纖維細胞鵝胚成纖維細胞乳兔腎細胞、雞胚成纖維細胞雞胚成纖維細胞、犬腎細胞、Ｖero細胞MDCK細胞、犬睪丸細胞、腎細胞(CCL64)Ｖero細胞，犬、猴腎細胞ＦＫ81細胞、NLFK細胞、CRFK細胞、FLF31細胞、貓腎細胞ＦＫ81細胞、NLFK細胞、CRFK細胞，貓、水貂腎細胞 水貂腎細胞（1）血清 細胞培養(yǎng)必須加入一定量血清。大多數(shù)病毒細胞培養(yǎng)維持液不加血清，但對同步接毒的病毒細胞培養(yǎng)，如細小病毒必須加入一定量血清。8℃條件下能在貓腎細胞復(fù)制增殖。~，有利于病毒增殖。為獲得培養(yǎng)液中典型病毒和高度感染性，接種時必須用高稀釋度的病毒液，如應(yīng)用高濃度的病毒也傳代，在第3~4代時會出現(xiàn)明顯的缺陷病毒，發(fā)生自我干擾現(xiàn)象，病毒滴度下降。多數(shù)病毒采用該種接毒方式。但支原體污染使病毒增殖強的例子也有報道，如精氨支原體污染的鼠胚成纖維細胞上增殖水泡性口炎病毒，病毒滴度可增加1個對數(shù)單位值。如精氨酸支原體通過抑制水泡性口炎病毒對干擾素的誘導(dǎo)而使病毒增殖增強。4．病毒增殖指標與收獲 多數(shù)病毒在敏感細胞增殖可引起細胞代謝等到方面的變化，發(fā)生形態(tài)改變，即細胞病變（CPE），顯微鏡下主要表現(xiàn)為：（1）細胞圓縮。（3）細胞融合形成合胞體。包涵體和血凝性也可作為檢查病毒增殖的