【正文】 1革蘭氏反應(yīng)陽性………………………………棒桿菌屬(Clavibacter)如馬鈴薯環(huán)腐病菌()1革蘭氏反應(yīng)陰性 2鞭毛極生 3鞭毛數(shù)根，菌落白色，可發(fā)熒光…………………………………………………假單胞桿菌屬(Pseudomonas) 兩液分配成后混合 2魯戈爾（Lugol）碘液 碘 1克，碘化鉀 2克，蒸餾水 300毫升 碘和碘化鉀在研缽中充分研磨，溶于水中，貯放在茶色磨口玻璃瓶中。 乙液：硝酸銀2克，蒸餾水100毫升。 配方2： 單寧酸 3%%苯酚， 氯化鈉 %的水溶液， 堿性品紅 %的95%酒精（pH ）溶液。 實驗十五 2內(nèi)部病變及內(nèi)含體的觀察 有些病毒一般不使植物組織壞死，而抑制其發(fā)育，常引起內(nèi)部形態(tài)的變化，試取受花葉病危害的煙草病葉，于深綠的部分與黃綠部分的交界處，進(jìn)行切片觀察，深綠部分與黃綠部分的細(xì)胞(包括柵欄組織及海綿組織)大小有無不同? 細(xì)胞間隙如何? 其中葉綠體的含量及大小有何不同? 另外，有些病毒特別是花葉型的病毒，還可在病株的細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)內(nèi)含體，這種內(nèi)含體也可作為鑒定病毒的根據(jù)，內(nèi)含體有四種類型，一般在光學(xué)顯微鏡下可見的有非結(jié)晶體(亦稱無定形體或x體和結(jié)晶體兩種，取表現(xiàn)出典型花葉癥狀的新鮮煙草病葉，取其葉片褪色(淺綠色)部分，將其表皮撕下，制片鏡檢，注意觀察在葉背主脈的表皮或茸毛中，除細(xì)胞核內(nèi)有否圓形、橢圓形或其它不規(guī)則形物體存在? 其位置及大小如何？是否具有折光性? (二)植物病毒的傳染性觀察 傳染途徑是病毒的鑒定性狀，也是防治的重要依據(jù)，植物病毒可以通過多種途徑進(jìn)行傳染，植物病毒的接種方法與它的傳染途徑有關(guān)。 2昆蟲傳染 昆蟲傳染是自然條件下植物病毒的一種主要傳染方式，它是以昆蟲為媒介，將病毒從病株到健株體內(nèi)，蚜蟲是植物病毒最主要的蟲媒，蚜蟲傳毒實驗步驟如下： (1)蚜蟲準(zhǔn)備 接種前到田間無病的十字花科蔬菜上，用毛筆輕輕采集蚜蟲，經(jīng)過飼養(yǎng)證實蚜蟲不帶毒后方能應(yīng)用。 同樣將饑餓后的蚜蟲放在無病毒的植株上吸食10分鐘，然后用毛筆移到另一株無病接種株上作為對照，其它方法同上。 (1)取煙草花葉病的病葉數(shù)片，用清水洗凈，放消毒研缽中磨碎，擠出其汁液。 2稀釋終點（Dilution End Point，DEP） 病毒汁液不斷稀釋到一定限度后就失去致病力，不能致病的稀釋度，即保持病毒侵染力的最高稀釋度就是稀釋終點，稀釋終點的測定亦是以不同的范圍進(jìn)行，逐步測試。 (3)將稀釋后的病毒汁液分別倒入消毒培養(yǎng)皿中，按汁液接種法分別接種到煙草上，觀察其是否具有侵染力。 體外存活期（Longevity in vitro，LIV） 體外存活期即體外保毒期，為在室溫下（2022）下，病毒抽提液保持侵染力的最長時間。五、所需學(xué)時 2學(xué)時。 本實驗的目的是熟悉植物病原線蟲的基本形態(tài)及其所致病害的癥狀特點，以及學(xué)習(xí)分離和鑒定主要植物病原線蟲的方法。根據(jù)線蟲尾部側(cè)面感覺孔——側(cè)尾腺口的有無，線蟲綱分為側(cè)尾腺口綱(Secernentea)和無側(cè)尾腺口綱(Adenophorea)兩個綱，植物寄生線蟲絕大多數(shù)在側(cè)尾腺口綱中，其中主要是墊刃目(Tylenchida)的線蟲對植物有致病性，特別是該目中墊刃總科(Tylenchoidea)和滑刃總科(Aphelenchoidea)中的一些線蟲，以下學(xué)習(xí)五個重要屬。 2 莖線蟲屬(Ditylenchus)( ?？艫nguinidae) 挑取甘薯莖線蟲病病組織制片鏡檢雌雄蟲體形態(tài)，注意雌蟲陰門位置，雄蟲交合傘不包至尾尖，交合刺基部變寬，并有突起等特點。 2 淘洗過篩分離法——土壤中胞囊線蟲分離 材料：發(fā)生在大豆胞囊線蟲病的大豆田土壤。 四、思考題 1植物寄生線蟲為害植物可引起些什么特殊的癥狀? 為什么將植物寄生線蟲當(dāng)作重要的病原生物看待? 2植物病原線蟲包括那些重要類群? 這些類群是怎樣劃分的? 附：寄生性種子植物形態(tài)及其所致病害癥狀觀察 寄生性種子植物由于缺少葉綠素或器官退化，靠寄生在其他種子植物上生活，因此也成了植物的病原生物，這類病原物種類不多，生產(chǎn)上比較重要的只有菟絲子一種，列當(dāng)是重要的檢疫對象；從寄生部位分，菟絲子屬莖部寄生，列當(dāng)屬根寄生。 7 陸家云主編，2001，植物病原真菌學(xué)，北京：中國農(nóng)業(yè)出版社 8 沈陽農(nóng)學(xué)院植保系植病教研室，普通植物病理學(xué)實驗指導(dǎo)書，全國中專師訓(xùn)班用 9 沈陽農(nóng)學(xué)院植物病理教研室，1980，普通植物病理學(xué)實驗指導(dǎo) 10 王金生主編，2000，植物病原細(xì)菌學(xué)，北京：中國農(nóng)業(yè)出版社 11 魏景超，1979，真菌鑒定手冊，上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社 許志剛主編，1997，普通植物病理學(xué)（第二版），北京：中國農(nóng)業(yè)出版社 二、內(nèi)容、材料和方法 徒手制片的方法有整體封藏法、徒手切片法、組織透明制片法和涂抹制片法等多種。 1挑：對于在植物受病部位或基質(zhì)表面生長繁茂的霉?fàn)畈≡w(如霜霉菌)粉狀病原體(如銹菌、白粉菌)以及培養(yǎng)基上的許多培養(yǎng)菌，可用尖細(xì)的解剖針等直接挑取封埋制片，挑取病原體的量，在保證選材典型的前提下，越少越好，以免互相重疊，分辯不清。浮載劑在保證浮載質(zhì)量的前提下要盡量少，否則少量的病原體在大滴的浮載劑中極易分散漂流，在顯微鏡下難以尋找。取小麥全蝕病或白粉病標(biāo)本，撥小黑點制片，鏡檢子囊果的形態(tài)。 (二)徒手切片法 欲觀察受病組織病變，病菌侵入和寄主體內(nèi)擴(kuò)展過程，以及埋生在基物內(nèi)真菌子實體的形態(tài)結(jié)構(gòu)等，都需將有關(guān)材料切成薄片，進(jìn)行鏡檢，徒手切片是最常用的簡便易行的方法，不需要特殊的設(shè)備，而且節(jié)省時間，切成的片子不僅可作臨時觀察，也可進(jìn)一步制成永久性玻片標(biāo)本。注意刀口必須以材料面垂直。 對于過于柔軟或較薄的材料，可以夾在“夾持物”中，進(jìn)行切片更為方便。 徒手切片的缺點是對于微小或過大，柔軟、多汁、肉質(zhì)及堅硬的材料不易切取，也難制成連續(xù)切片，此外切片的厚薄也難一致。 2乳酚油：也較常用，成分及配比如下： 苯酚結(jié)晶(加熱熔化)20ml 乳酸20ml 甘油40ml 蒸餾水20ml 乳酚油不易干燥，標(biāo)本可存放幾天以上，為使標(biāo)本易于辯別，常在其中加染料苯胺藍(lán)(棉藍(lán))，—%(—%的錐蟲藍(lán)等)，因其是酸性染料，可染真菌原生質(zhì)而不染細(xì)胞壁，故對分隔難辨的真菌孢子等可由此染色而看清。 3 甘油乳酸液：也可加苯胺藍(lán)等染料，其成分如下： 乳酸 500ml 甘油 1000ml 蒸餾水 500ml 4水合氯醛碘液：成分配比如下： 水合氯醛 100g 碘化鉀 5g 碘 水 100ml 碘與碘化鉀研和，加水溶解。 徒手切片及其它標(biāo)本，都可用此劑浮載制片，標(biāo)本染色(或不染)后，先用甘油脫水(干燥標(biāo)本可不脫水)，挑取小團(tuán)甘油明膠放在載片上，微加熱，待其熔化而氣泡消失后，將標(biāo)本取出吸除去多余甘油后移入熔化的甘油明膠中，加蓋玻片輕輕下壓，擦去蓋玻片周圍的多余甘油明膠。培養(yǎng)基的配制和滅菌 一、 實驗?zāi)康? 微生物的生長發(fā)育都有一定的營養(yǎng)需要，培養(yǎng)基即人工培養(yǎng)微生物、為其生長發(fā)育提供所需營養(yǎng)的基質(zhì)。 成分：馬鈴薯200克 蔗 糖 10克 瓊 脂 20克 加水至1000毫升 方法：將馬鈴薯洗凈去皮切塊，加水煮沸半小時，用雙層紗布濾去薯塊，補(bǔ)足水量，加入瓊脂，加熱熔化，再加糖，待完全化后，乘熱用雙層紗布過濾分裝，塞好棉塞高壓滅菌。 牛肉浸膏和酵母浸膏十分粘稠，不易稱重，稱重時用小燒杯盛裝，以玻璃棒沾取，故要先稱好杯和棒的重量后，再開始沾取浸膏稱重，稱后將杯和棒上粘著的浸膏洗凈于鍋中。也可以用多孔白色瓷板，在孔中加少量培養(yǎng)基和溴百里酚藍(lán)或其它指示劑1—2滴，根據(jù)顏色反應(yīng)，在所配的培養(yǎng)液中加入少量lN的NaOH或HCl，然后再取樣測定，如此反復(fù)多次，達(dá)到所需求的反應(yīng)為止。 滅菌的方法很多，植病實驗室常用的有干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌兩種方法，一般培養(yǎng)皿、吸管等玻璃儀器用干熱滅菌法進(jìn)行滅菌。 (4)待箱內(nèi)空氣排出到一定程度時，閉上排氣孔，繼續(xù)加熱至一定溫度后，用定溫固定溫度，滅菌溫度一般165℃—175℃保持1小時即可。 (3)通電加溫，同時打開排氣活門，排盡鍋內(nèi)的空氣，即活門沖出的全部是蒸氣時則表示徹底，此時可關(guān)閉排氣活門，如果過早關(guān)閉活門，排氣不徹底，也達(dá)不到徹底滅菌的目的。一般從排氣到打開鍋蓋以10分鐘左右為好。 此外，有些培養(yǎng)基在經(jīng)高壓滅菌后，其營養(yǎng)成分容易分解而失去使用價值，此時可采用間歇蒸氣滅菌法，即將培養(yǎng)基放入高壓滅菌器內(nèi)，加熱至100℃，保持1小時，每天滅菌一次，連續(xù)進(jìn)行三次，即可達(dá)到滅菌的目的，又不至使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)分解。分離和培養(yǎng)是植病實驗室最基本的操作技術(shù)之一。 (二)分離方法 病原菌分離的方法因材料不同而異，植病實驗室最常見的方法有組織分離法和稀釋分離法兩種。用10%漂白粉（次氯酸鈣）溶液消毒（漂白粉溶液現(xiàn)用現(xiàn)配）35min，時間長短依病組織不同而異，然后直接移至PSA平板培養(yǎng)基上(為防止細(xì)菌污染，可在培養(yǎng)基中加入1000ppm鏈霉素10毫升)，倒置于20—25℃室溫下，待菌落長出后挑取前緣菌絲，回接于PSA斜面培養(yǎng)基上，在25℃溫箱中培養(yǎng)，待菌落顏色變深后，在無菌條件下鏡檢是否是玉米大斑病菌，弱僅有玉米大斑病菌的孢子，則說明已獲得了純培養(yǎng)，否則，則需要繼續(xù)轉(zhuǎn)至斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，直至獲得純培養(yǎng)。 ：稀釋分離法適用于細(xì)菌、土壤菌及產(chǎn)生孢子多的真菌等病原菌的分離，本次實驗以白菜軟腐病作為材料進(jìn)行分類離。 以上分離實驗也可以劃線法進(jìn)行，方法是先取兩付滅菌培養(yǎng)皿，每皿倒入約15毫升熔化的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，沿桌面輕輕搖勻，制成平板，然后用移置環(huán)沾取一環(huán)稀釋好的菌懸液，在第一個培養(yǎng)皿平面培養(yǎng)基的左方長方形區(qū)內(nèi)劃平行線5—7條，再以此移置環(huán)繼續(xù)向右(和左方小區(qū)內(nèi)的幾條平行線成一定角度)劃5—7條平行線，依此法劃兩皿，倒置于26—28℃溫箱中培養(yǎng)，1—2日后挑單個典型菌落移到斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)待用。若限于條件實驗只能在普通房間進(jìn)行時，必須對房間進(jìn)行徹底掃除，清潔環(huán)境、搞好衛(wèi)生。 玉米大斑病病葉1片。 五、思考題 1分離植物病原菌常用的方法有幾種? 這些方法適用于分離哪類病原菌? 怎樣分離? 2分離植物病原物時，為什么要選擇新鮮病材料，并且在病健交界處取樣? 沒有新鮮病材料怎么辦? 3試分析分離工作成敗的原因。 欲了解病菌生活力的強(qiáng)弱，生存期的長短，有效傳播距離，抗藥性的大小，生活史，環(huán)境與發(fā)病的關(guān)系以及有些病菌的種類鑒定等，都必須進(jìn)行孢子萌發(fā)試驗。 孢子萌發(fā)的方法很多，有些真菌的孢子須用特殊的方法才能萌發(fā)，以下僅實驗常用的方法。 (一)懸滴法然后翻轉(zhuǎn)蓋片制成懸滴，并封閉在特制的玻環(huán)內(nèi)，再將玻環(huán)放在底部盛少許水的培養(yǎng)皿中，蓋好皿蓋，放置在26—28℃溫箱中培養(yǎng)，4—5小時后檢查萌發(fā)結(jié)果。 此法也可改用直接用培養(yǎng)皿蓋的里面作懸滴進(jìn)行，即用玻璃筆在皿蓋里面劃方格，在方格中央滴孢子懸液，然后慢慢轉(zhuǎn)皿蓋。 ：小麥根腐病菌斜面菌種。 ：在培養(yǎng)皿內(nèi)放一“井”字或“U”形玻璃棒，皿底加蒸餾水少許或襯上吸水紙或加幾個脫脂棉球吸水保濕，玻璃棒上放載玻片，其上分別滴2或3滴小麥根腐病菌孢子懸浮液〔濃度同(一)〕，蓋好皿蓋，置于26—28℃溫箱中培養(yǎng)，4—5小時后，鏡檢萌發(fā)結(jié)果。 此法也可發(fā)展為將配好的孢子懸液直接加在培養(yǎng)皿中進(jìn)行萌發(fā)，一般一個培養(yǎng)皿中加10毫升左右，不能太多，然后直接鏡檢萌發(fā)結(jié)果，優(yōu)點是一次可測定大量孢子。 (三)瓊脂培養(yǎng)基法保溫培養(yǎng)，麥稈銹菌夏孢子培養(yǎng)在20℃溫度下，麥白粉病分生孢子培養(yǎng)在10—12℃下，24小時后鏡檢萌發(fā)結(jié)果。 此法也可以直接在培養(yǎng)皿中做成的水瓊脂平板上進(jìn)行。 (四)載片引濕法滅菌后皿底加少許滅菌水，將濾紙條橫放在載玻片上，崩緊，兩端拖入水中，吸滴水，再在紙上滴一滴玉米瘤黑粉病菌黑粉孢子懸浮液，蓋上皿蓋，在25℃溫箱中培養(yǎng)，逐日檢查萌發(fā)的結(jié)果。 三、孢子萌發(fā)的記載方法孢子萌發(fā)是先吸水膨脹，然后長出芽管，通常以芽管長度超過孢子直徑一半(不是正圓形的孢子以短徑為準(zhǔn))作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，記載萌發(fā)的方法有以下幾種。 (一)萌發(fā)率 鏡檢玉米大斑病菌或小麥根腐病菌分生孢子的萌發(fā)率。 五、思考題 (2)將接目測微尺放在接目鏡內(nèi)，由鏡頭向下看，上面的格紋，應(yīng)極清楚。 (3)將鏡臺測微尺放在鏡臺上 鏡臺測微尺 接目測微尺 接目測微尺每格=10微米48/102=實驗五因此接種方法也不相同。 (二)噴霧法(玉米大斑病)氣流及雨水傳播的病害常用此法接種，將培養(yǎng)好的玉米大斑病的斜面菌種一支，用移植鉤刮于裝有100毫升無菌水的三角瓶中，用力振蕩，待孢子洗下后，以紗布過濾，即成孢子菌絲懸液，用衛(wèi)生噴霧器均勻噴布在麥苗上。塑料罩保濕48小時后揭布，正常管理，7天后作發(fā)病