【正文】 技術(shù)顧問： , 美國國立衛(wèi)生研究院 過敏及傳染病研究所 . 美國 大學醫(yī)學中心實驗室克林頓基金中國艾滋病防治項目實驗室專家 . 美國華盛頓大學新英格蘭研究所 . 加拿大公共衛(wèi)生局疾病預防控制中心國家免疫學實驗室前 言隨著病毒載量檢測在艾滋病臨床輔助診斷和抗病毒治療監(jiān)測以及艾滋病科研工作中的廣泛應用，我國開展該項檢測工作的實驗室日益增多。在通過考核和積累經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，年啟動了國內(nèi)病毒載量檢測能力驗證工作。本指南是根據(jù)各種病毒載量檢測方法的技術(shù)要求，結(jié)合現(xiàn)行的國內(nèi)外相關(guān)技術(shù)規(guī)范而制定。在此基礎(chǔ)上，經(jīng)過多次修訂、補充和審定，于年月完成《病毒載量檢測及質(zhì)量保證指南》的最后定稿。病毒載量檢測及質(zhì)量保證指南（版）目錄第一章 總則第二章 實驗室設(shè)置第三章 樣品的采集、處理、保存、運輸?shù)谒恼?常用病毒載量檢測方法簡介第五章 室內(nèi)質(zhì)量控制第六章 外部質(zhì)量控制第七章 實驗室生物安全附表 常見問題分析和處理附表 病毒載量檢測樣品送檢及接收單附表 病毒載量檢測能力驗證樣品接收專用單附表 病毒載量檢測報告單附表 病毒載量能力驗證結(jié)果專用報告單（)附表 病毒載量能力驗證結(jié)果專用報告單（)參考文獻縮略語第一章 總 則意義 病毒載量是艾滋病防治工作中一項重要的實驗室檢測指標。適用范圍 適用于我國開展病毒載量檢測工作的所有實驗室。具體來說： ，有條件各區(qū)內(nèi)可分別設(shè)置緩沖間，以保證不同區(qū)之間始終完全分隔開?？砂惭b排風扇或其他排風裝置。用于病毒載量檢測的樣品推薦采用抗凝血漿。 樣品采集量：通常采集全血～, 采集的樣品量應盡可能與定量采血管的刻度一致，采集量過多或不足，會造成血液凝固或被稀釋。 分離后，吸出血漿，分裝到無菌的聚丙烯螺口凍存管中，并注明分裝時間。 樣品的保存：根據(jù)血漿檢測時間而定，天內(nèi)可在4℃暫時保存，個月以內(nèi)應凍存于20℃以下，個月以上應置于70℃以下。、泄漏及污染。. 樣品管破損造成樣品溢出、出現(xiàn)明顯溶血、凝血的樣品，不宜作病毒載量檢測；如果樣品已經(jīng)融化， 4℃保存并盡快檢測，記錄凍融一次。此方法可分成四個步驟：核酸釋放、提取、擴增和測定。 結(jié)合（核酸序列基礎(chǔ)分析）技術(shù)與分子熒光探針技術(shù)（ ）檢測血漿中的 水平。該檢測試劑盒可以通過兩種樣品處理程序進行檢測，即標準的和超敏感的操作步驟，定量測定含量為拷貝毫升 。 試劑盒版包括個主要步驟：試劑準備；樣品制備；靶的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生；用特異互補引物進行靶 擴增；通過比色與探針結(jié)合的擴增產(chǎn)物的測定。 分析儀根據(jù)定量標準品的數(shù)據(jù)計算每一個樣品的 的含量。本方法定量系統(tǒng)中沒有內(nèi)標記物，每次實驗設(shè)置一系列外部標記，通過實驗樣品反應強度與外部標記樣品強度的比較確定實驗樣品的病毒拷貝數(shù)。發(fā)射的光強以相對光量值()表示。每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系。（） ，檢測的產(chǎn)物使用熒光標記的寡核苷酸探針。循環(huán)數(shù)與樣品載量成線性關(guān)系。 所有相關(guān)檢驗人員需經(jīng)操作培訓，能獨立熟練地操作，并經(jīng)考核合格，持證上崗。 試劑準備區(qū)：擴增試劑的配制、分裝和保存； 樣品處理區(qū)：樣品登記、分裝，核酸提取、保存和加樣； 擴增產(chǎn)物分析區(qū)：產(chǎn)物擴增的測定、結(jié)果分析、登記及報告。，用乙醇或次氯酸鈉及時處理操作臺面。、水浴箱用校準合格的溫度計測量溫度，并做好記錄。 實驗用水：要求使用無和酶的水。用無菌凍存管定量分裝，標記，封口，凍存于80℃以下非自動除霜冰箱內(nèi)。每次檢測都應帶個外部對照，將得到的外部對照值標在質(zhì)控圖上，根據(jù)是否在 值范圍判斷實驗結(jié)果是否有效，每次測得值在平均值177。 數(shù)據(jù)分析、結(jié)果報告 在試劑盒及外部質(zhì)控品結(jié)果滿足要求的前提下，對樣品進行分析。 簽發(fā)人對結(jié)果的結(jié)論進行審核、分析、總結(jié)、簽字。通過參加考核，保證艾滋病參比實驗室的不同病毒載量檢測系統(tǒng)的有效性。鼓勵有條件的實驗室參加國際組織的活動。 T樣品的接收與保存：要求參加的實驗室收到考核樣品后，立即進行核對、檢查，填寫病毒載量檢測能力驗證樣品接收專用單（附表），天內(nèi)將接收專用單傳回艾滋病參比實驗室。 T結(jié)果的報告和處理：參加的實驗室必須在規(guī)定的時間內(nèi)（收到樣品個月內(nèi)），用電子郵件報告實驗結(jié)果，并將病毒載量實驗結(jié)果報告單（附表）和打印的儀器原始記錄一起上報給艾滋病參比實驗室，后者將負責結(jié)果錄入和處理。內(nèi)；一個假陽性；一個無效結(jié)果；一個抄寫錯誤。：參評實驗室如對評估結(jié)果或其它方面存有異議，可以在收到結(jié)果后天內(nèi)向艾滋病參比實驗室提出異議，后者在核實情況后予以答復。安全細則、戴口罩、戴一次性乳膠手套。當具有潛在傳染性的物質(zhì)溢出時，立即用次氯酸鈉溶液或其它消毒劑處理污染區(qū)及器材；接觸過標本的器材應置有專用消毒劑的容器，與一次性物品一起在丟棄前進行高壓滅菌處理。附表 常見問題分析（一）問題原因 處理方法血清或血漿樣品中有特殊物質(zhì) 化凍緩慢引起的細胞裂解離心至上清清亮 硅膠難以重新懸浮 樣品中核酸水平太高 劇烈震蕩混懸，由于洗滌洗脫效率不高可影響敏感度。. （二）問題原因 處理方法無效（）稀釋系列的數(shù)值未在檢測的吸光度范圍內(nèi)。報告結(jié)果根據(jù)所采取的標準的或極度敏感的提取方法可以是“ 沒有檢測到（ 低于拷貝毫升）”或“ 沒有檢測到（低于拷貝毫升）”。報告的結(jié)果應乘以稀釋因子。對于標準的樣品處理程序，結(jié)果可以報告為“檢測到 , 含量低于拷貝毫升”。對于標準的樣品處理程序，結(jié)果可以報告為“ 含量高于180。對于極度敏感的樣品處理程序，重新檢測。所有靶模板的數(shù)值都不在線性測定范圍之內(nèi)。重復整個實驗步驟包括樣品和質(zhì)控的制備、擴增和檢測。確信加入酶和開始此輪運行之間的時間少于分鐘。分析儀底部的加熱托盤上有液體管路連接松弛或一洗頭的分液或吸液針管堵塞。分析儀不能從孔內(nèi)吸取足夠的液體洗頭中有堵塞, 洗頭針頭彎曲, 廢液管連接松弛, 吸液泵損壞。值高實驗被污染, 清洗不充分, 或有光泄露。標準曲線平坦或不正常加標準時板的缺口在右邊,或標準加入順序有誤。確定試劑盒在運輸和到貨后儲存在正確的溫度；使用無菌槍頭；沒有吸取氣泡；封閉墊組裝無誤；加樣器經(jīng)校準；小心處理測試板,防止濺灑；標準和對照加樣位置正確；按產(chǎn)品說明要求儲存, 配制；樣品,標準,對照在吸取前至少震蕩秒。4. . .5. ， ， , ()。10. 《人間傳染的高致病性病原微生物實驗室和實驗活動生物安全審批管理辦法》，衛(wèi)生部第號令，年月日起實施