核酸提取及常見問題分析-預(yù)覽頁
【正文】 問題、 原因分析及其對策 第三部分： RNA提取方法簡介 第四部分： RNA提取及其 RTPCR常見 問題、原因分析及其對策 DNA提取的幾種方法 ? 基因組 DNA的提取 ? CTAB法 ? SDS法 ? 其它 DNA提取的幾種方法 ? 非基因組 DNA的提取 ? 質(zhì)粒 DNA的提取 ? 堿裂解法 ? 煮沸法 ? 線粒體、葉綠體 DNA的提取 ? 差速離心結(jié)合 SDS裂解法 基因組 DNA－ CTAB法 ? CTAB法原理 （植物 DNA提取經(jīng)典方法） ? CTAB（ hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。 基因組 DNA－ CTAB法 ? CTAB法流程圖 植物材料 裂解液 上層溶液 液氮研磨 抽提 細(xì)胞裂解 干燥溶解 離心洗滌 酒精沉淀 DNA溶液 基因組 DNA－ CTAB法 ? SDS法原理 基因組 DNA－ SDS法 ? SDS是一種陰離子去垢劑 ， 在高溫 （ 55～ 65℃ ） 條件下能裂解細(xì)胞 ， 使染色體離析 ， 蛋白變性 ， 釋放出核酸； ? 提高鹽 (KAc或 NH4Ac)濃度并降低溫度 （ 冰浴 ） ， 使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀 ， 離心后除去沉淀； ? 上清液中的 DNA用酚 /氯仿抽提 ， 反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 適用于純度要求高的實驗。 細(xì)胞器 DNA－差速離心法 ? 差速離心法原理 ? 是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。 ? 用多糖水解酶將多糖降解。 原因 對 策 1. 材料不新鮮或反復(fù)凍融 2. 未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性 3. 提取過程操作過于劇烈， DNA被機(jī)械打斷 4. 外源核酸酶污染 5. 反復(fù)凍融 1. 盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融 2. 液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液 3. 在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的 DNA時，可增加裂解液中螯合劑的含量 4. 細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔 5. 所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌 6. 將 DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融 DNA提取常見問題 ?問題二： DNA降解。 ? 裂解變性 ： 異硫氰酸胍 （ 亞硫氫胍，巰基乙醇， N月桂肌氨酸等）。 ? 洗滌： 70％乙醇。 RNA提取的通用方法 影響 RNA提取的因素 ? 材料 ： ? 新鮮，切忌使用反復(fù)凍融的材料 ? 如若材料來源困難，且實驗需要一定的時間間隔。 建議在液氮條件下將組織碾碎 ， 并且勻漿時使用更多裂解液 。 ? 減少起始樣品量 ， 確保裂解完全 、 徹底 ? 解決辦法 :重新抽提一次 ， 再沉淀 ， 溶解 。 ? 解決辦法 :再沉淀一次后 ， 溶解 。 用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值的降低 。端沒有互補(bǔ)序列的引物 優(yōu)化鎂離子濃度 可能原因 解決方案 RT常見問題分析和解決方案 問題三： 產(chǎn)生彌散（ smear）條帶 ? 第一鏈產(chǎn)物的含量過高 ? PCR反應(yīng)中引物過多 ? 循環(huán)數(shù)過多 ? 退火溫度過低 ? 寡核苷酸片段產(chǎn)生的非特異性擴(kuò)增 常規(guī) PCR步驟中減少第一鏈產(chǎn)物的量 減少引物的用量 減少 PCR的循環(huán)次數(shù) 提高退火溫度 提取高質(zhì)量 RNA，防止被 DNA污染 可能原因 解決方案 謝謝！ 北京天為時代科技有限公司 // 本公司產(chǎn)品江蘇地區(qū)特約代理商 南京天為生物科技有限公司 聯(lián)系電話： 02586073713 84705301 84701501 24小時訂貨熱線： 13057585177 聯(lián)系人：王彤 免費技術(shù)支持： 800 810 2177
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