病毒感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)整體流程與原理-預(yù)覽頁(yè)
【正文】 長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定表達(dá)。病毒的種類(lèi)病毒有很多種，常見(jiàn)的有慢病毒和腺病毒慢病毒（Lentivirus）是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種。3） 可用于基因敲除、基因治療和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究。2） 慢病毒載體，包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞293T等。6） 滴度測(cè)定目的基因檢定，并出具檢測(cè)報(bào)告。1） 幾乎可以感染所有類(lèi)型的細(xì)胞2） 可以獲得復(fù)制缺陷型 (E1 和 E3 缺失) 的腺病毒3） 病毒滴度高，產(chǎn)生病毒經(jīng)過(guò)濃縮后可以達(dá)到 1012 PFU/mL，能有效的進(jìn)行增殖。4） 將病毒粗提液感染 293A 細(xì)胞以擴(kuò)增病毒。有些質(zhì)粒稱(chēng)為附加體(episome)，這類(lèi)質(zhì)粒能夠整合進(jìn)真菌的染色體，也能從整合位置上切離下來(lái)成為游離于染色體外的DNA分子。1）從大腸桿菌平板上挑取一個(gè)單菌落于3mlLB培養(yǎng)基的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。4）加入350ul溶液Ⅲ（中和液），立刻輕柔地反復(fù)顛倒混勻56次，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。8）加入500ul溶液PB（洗滌液）12000轉(zhuǎn)離心1min，棄濾液，目的是將硅膠膜上吸附的蛋白、鹽等雜質(zhì)洗脫，以獲得高質(zhì)量質(zhì)粒DNA。12）12000轉(zhuǎn)離心1min，此時(shí)管底即為高純度的質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒于20℃保存。確保第二天細(xì)胞密度達(dá)到80%90%融合度第二天：1. 500ul 無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋2ug 表達(dá)質(zhì)粒+ psPAX2+ 2. 500ul 無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋15ul 脂質(zhì)體20003. 5min后，將DNA溶液和脂質(zhì)體溶液混合，室溫靜止20min4. 從6孔板中吸出1ml無(wú)血清培養(yǎng)基，然后滴加入1ml質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合物。、分裝80176。在上述程序中提及的“第四天”收集病毒。打開(kāi)熒光器（30min內(nèi)不能關(guān)閉，否則影響顯微鏡壽命），細(xì)胞培養(yǎng)板置于載物臺(tái)，調(diào)節(jié)物鏡和光圈，先用自然光觀察視野內(nèi)細(xì)胞，再關(guān)閉光，開(kāi)啟熒光通道，觀察熒光強(qiáng)度，判定感染率。，可進(jìn)行濃度梯度感染，計(jì)算細(xì)胞感染復(fù)數(shù)。：RT是一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄的過(guò)程，用前一天提取好的總RNA，在加入引物，模版和酶，并在PCR儀的溫度設(shè)置下，RNA可逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。 第二步把凝膠中已分成條帶的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到一種固相支持物上， 用得最多的材料是硝酸纖維素膜(NC 膜)和 PVDF 膜， 蛋白轉(zhuǎn)移的方法多用電泳轉(zhuǎn)移 （轉(zhuǎn)移電泳） ，它又有半干法和濕法之分，現(xiàn)在大多用濕法。該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)中。用一些事情，總會(huì)看清一些人。4. 歲月是無(wú)情的，假如你丟給它的是一片空白，它還給你的也是一片空白。學(xué)習(xí)參考
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