病毒感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)整體流程與原理-全文預(yù)覽
【正文】 液，重復(fù)一遍——將制備管置回2ml離心管12000轉(zhuǎn)離心1min——，加60~80ulEluent或離子水，室溫1min12000轉(zhuǎn)離心1min——移去制備管，將有質(zhì)粒的離心管于4℃或是20℃保存質(zhì)粒DNA和其他包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞產(chǎn)生病毒（即病毒包裝）, 表達(dá)SV40大T抗原的人腎上皮細(xì)胞系, 被廣泛應(yīng)用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染以過表達(dá)各種目標(biāo)蛋白, 或是用以包裝病毒。9）加入500ul溶液W（去鹽液），12000轉(zhuǎn)離心1min，棄濾液，重復(fù)一次。5）12000室溫離心10min，收集上清。2），37℃振蕩培養(yǎng)2~3h3）菌液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，冰上放置10min4）4℃離心10min（4000r/min）5）倒出培養(yǎng)液，將管口倒置以便培養(yǎng)液流盡6），立即冰浴30min7）4℃離心10min（4000r/min）8）倒出上清液，（冰上放置）9）分裝細(xì)胞，200ul一份，4℃保存1）取200ul新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞，加入質(zhì)粒DNA2ul混勻，冰浴30min2）離心管放到42℃保溫90s3）冰浴2min4）每管加800ulLB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)1h（150r/min）5）取適當(dāng)體積（100ul）的復(fù)蘇細(xì)胞，涂布在選擇性培養(yǎng)基上，正置30min6）倒置平皿37℃，12~16h，出現(xiàn)菌落1）取1~4ml在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的菌液，12000轉(zhuǎn)離心1min，棄上清2）加250ul溶液Ⅰ/RNaseA（溶液Ⅰ為細(xì)胞懸浮液）混合液，漩渦劇烈振蕩直至菌體完全重新懸浮，室溫靜置12min。質(zhì)粒在宿主細(xì)胞體內(nèi)外都可復(fù)制。5） 分裝，80℃保存。4） 腺病毒載體感染宿主的范圍比較廣，制備容易，操作簡單.5） 感染細(xì)胞時(shí)，不整合到染色 體中，不存在激活致癌基因或插入突變等危險(xiǎn)，生物安全性高。、腺病毒 原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一種無包膜的線狀雙鏈DNA病毒，其復(fù)制不依賴于宿主細(xì)胞的分裂。3） 培養(yǎng) 48hrs 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培養(yǎng)液。4） 無需任何轉(zhuǎn)染試劑，操作簡便。構(gòu)建的siRNA / miRNA慢病毒載體，與化學(xué)合成的siRNA 和基于瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建的普通 siRNA 載體相比，一方面可以擴(kuò)增替代瞬時(shí)表達(dá)載體使用，另一方面，LentivirussiRNA 克隆經(jīng)過慢病毒包裝系統(tǒng)包裝后，可用于感染依靠傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系如原代細(xì)胞、懸浮細(xì)胞和處于非分裂狀態(tài)的細(xì)胞，并且在感染后可以整合到受感染細(xì)胞的基因組，進(jìn)行
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