【正文】 romyces cerevisiae growth and fermentation under ethanol stress, through detecting physiological indicatiors including cell growth, the membrane integrity, superoxide anion(O2 and H2O2, leding to the oxidative stress, resulting in the damage to yeast cells. When the growth inhibited serious, ethanol even could lead to the death. GSH and Met, NAC could clear the excess of ROS, reduce the yeast damage caused by ethanol stress and improve the ethanol yield.In order to understand whether autophagy was involved in the ethanol stress in the S. cerevisiae as well as it was related with ROS, we used 3MA (autophagy inhibitor) and rapamycin (autophagy inducer) to treat ethanolstressed Saccharomyces cerevisiae, the membrane integrity was by PI staining, the level of O2cerevisiae；ethanol stress；autophagy；ROS縮略詞英文縮寫英文全稱中文名稱BSABovine serum albumin牛血清白蛋白CvtCytoplasm to vacuole targeting細(xì)胞質(zhì)到液泡途徑DAB3, 3180。含量測定（NBT法） 15 15………………………………………………………………15第三章 結(jié)果與分析 17 乙醇對釀酒酵母生長發(fā)育的影響 17 18 GSH、Met和NAC對乙醇脅迫釀酒酵母的影響 19 19 20 22 24 28………………………………………..28 29……………………………………………………..29 32 33 討論 35 ROS增加是乙醇脅迫抑制釀酒酵母生長的主要原因 35 Met可以恢復(fù)乙醇對釀酒酵母的損傷 36 自噬通過減少ROS降低乙醇脅迫損傷 36第四章 結(jié)論 37參考文獻(xiàn) 38致謝 41個人簡歷 43第一章 前 言 乙醇對酵母的影響釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一種重要的工業(yè)微生物，由于其在發(fā)酵工業(yè)中的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致國內(nèi)外很多學(xué)者將其對環(huán)境脅迫因素的反應(yīng)作為研究重點(diǎn)[1]，而提高釀酒酵母對環(huán)境脅迫因素的耐受性對食品，釀酒等工業(yè)的生產(chǎn)具有重要的實(shí)際意義。酵母菌對乙醇的耐受性受多種基因的共同調(diào)控，這與乙醇能對酵母造成多方面的損傷及毒害作用相一致。而酵母細(xì)胞可以改變膜的組成來減少膜的流動性，使質(zhì)膜處于穩(wěn)定狀態(tài)。URA7 編碼 CTP 合成酶，主要負(fù)責(zé)磷脂的生物合成及嘧啶的從頭合成。脂肪酸 大量實(shí)驗(yàn)表明，在乙醇脅迫作用下，細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)成分發(fā)生了改變，單不飽和脂肪酸的含量明顯提高。為了探明不飽和脂肪酸各種組成在乙醇脅迫中的作用，分別將使ScOLE1(釀酒酵母?9脂肪酸脫氫酶基因)，CaFAD2 (白假絲酵母?12脂肪酸脫氫酶基因)，和CaFAD3 (白假絲酵母ω3脂肪酸脫氫酶基因)基因在酵母中過表達(dá)。、HO2和LOOH，具有比氧更活潑的化學(xué)性質(zhì)。但在某些特殊的情況下，比如細(xì)胞自身氧化還原代謝紊亂或外界離子輻射等原因就會造成細(xì)胞內(nèi)ROS的大量積聚，這種超過了細(xì)胞抗氧化防御緩沖能力的ROS可以攻擊蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及DNA等細(xì)胞組分而造成生物大分子的損傷，進(jìn)而影響細(xì)胞的功能甚至造成細(xì)胞死亡[1315]。蛋白質(zhì)損傷[17] 在ROS產(chǎn)生的部位附近的氨基酸殘基、肽鏈、蛋白質(zhì)、酶是ROS首先攻擊的目標(biāo)。生物膜還有較多的多不飽和脂肪酸，由于不飽和脂肪酸雙鍵電子云密度大，化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定，容易發(fā)生脂質(zhì)過氧化，從而導(dǎo)致膜功能和結(jié)構(gòu)的損傷[19]。研究已經(jīng)表明，氧化損傷是引起DNA損傷的一個主要原因，在一定程度上被認(rèn)為是造成SSBs and DSBs的前提因素[23]。ROS防御系統(tǒng)主要分為非酶類和酶類兩種。具有多種生理功能，主要體現(xiàn)在：清除自由基，保護(hù)細(xì)胞；參與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)；解除外源性物質(zhì)的毒性；參與轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)，維持肝細(xì)胞正常功能；維持D N A 的生物合成，細(xì)胞的正常生長及細(xì)胞免疫等多種生理功能等。主要功能是參與蛋白質(zhì)的合成。脂質(zhì)過氧化會損害初級和次級溶酶體膜，是溶酶體內(nèi)含有的作為水解的酸性磷酸酶釋放出來，對細(xì)胞核線粒體膜等重要的細(xì)胞器造成損害，甲硫氨酸通過多種途徑抗擊這些損傷。是所有氧自由基中的第一個生成的自由基，在超氧化物歧化酶的催化作用下，可以被還原為H2O2。所有這些不同形式的酶體都參與了細(xì)胞抗氧化攻擊。自噬可以是非選擇的，也可以是選擇性的。其主要功能是將α甘露糖苷酶(Ams1)和氨肽酶(Ape1)等兩種水解酶的前體定向轉(zhuǎn)移至液泡中。線粒體自噬。利用全基因組篩選線粒體自噬基因缺失突變體，Tomotake Kanki等人發(fā)現(xiàn)Atg32是線粒體自噬的關(guān)鍵蛋白（但不是自噬和其他選擇自噬的關(guān)鍵蛋白）。過氧化物酶體負(fù)責(zé)脂類代謝與細(xì)胞內(nèi)過氧化物的降解，其生成與降解受到嚴(yán)格的調(diào)控。、意義 (1) 以往研究表明，乙醇導(dǎo)致的細(xì)胞損傷有可能是過量的ROS產(chǎn)生的氧化脅迫所致。(2) 自噬在細(xì)胞存活和物質(zhì)平衡方面起著重要作用，為了探明自噬是否參與了釀酒酵母乙醇脅迫，以及自噬在乙醇脅迫中起了什么作用，在乙醇脅迫中，自噬和ROS之間是否有聯(lián)系，這些問題都值得深入探討。第二章 材料與方法 實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑（1）菌種本實(shí)驗(yàn)室從安琪酵母粉中提取的釀酒酵母菌（2）主要儀器設(shè)備。按以下不同處理設(shè)置實(shí)驗(yàn)，每個處理3個平行。：本實(shí)驗(yàn)采用Bradford法測定蛋白含量[30]，具體方法如下：1）蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 按下表順序依次加入各試劑： 蛋白質(zhì)含量測定所加試劑表管號1234561mg/ml BSA(ml)0蒸餾水(ml)10考馬斯亮藍(lán)G250(ml) 555555充分混勻，10 min后于595 nm下測定光吸收值。 酒精含量測定1)密度瓶質(zhì)量的測定 將密度瓶洗凈、干燥、反復(fù)稱重，直至恒重，記錄密度瓶質(zhì)量 (m)。取不同處理釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)液5 ml，10 000 g，4 ℃離心5分鐘，收集菌體。得到的菌體重懸于同體積的無菌去離子水中洗滌兩次，使用 2′,7′dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFHDA。得到的菌體重懸于同體積的無菌去離子水中洗滌兩次，使用DHE 測定胞內(nèi)O2 O2接著用960 181。得到的菌體重懸于同體積的無菌去離子水中洗滌兩次。MDA(mmol采用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為480和530 nm下測定Rh123的熒光強(qiáng)度。P ，用*表示， P ，用**表示。C下孵育72 h，記菌落數(shù)。C for 72 h and the colonies were counted. Each rectangle represents the mean 177。取不同濃度無水乙醇處理一定時間的對數(shù)期釀酒酵母，按10倍梯度稀釋過后，各取2 μl點(diǎn)在YPD固體培養(yǎng)基上，將點(diǎn)有不同濃度梯度酵母細(xì)胞的YPD固體平板于30176。以下實(shí)驗(yàn)無特別說明酒精處理時間均為1 h。標(biāo)準(zhǔn)誤（n=3）。PI不能穿過完整的活細(xì)胞的細(xì)胞膜，而受損或壞死的細(xì)胞由于失去細(xì)胞膜的完整性，PI可進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)與其內(nèi)DNA結(jié)合，發(fā)出波長為617 nm左右的紅色熒光。用熒光酶標(biāo)儀測定其熒光強(qiáng)度也表明，乙醇可以明顯提高PI染色細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，5%的乙醇處理組的熒光強(qiáng)度幾乎是對照的兩倍，10%和20%兩處理組熒光強(qiáng)度幾乎一樣，都接近對照的三倍（）。研究表明GSH在氧化脅迫，重金屬脅迫，等各種壓力下都有重要作用。Hu H等人研究表明添加LMet可以提高過表達(dá)Methionine adenosyltransferase (MAT)重組畢赤酵母中SAM的水平[37]。 GSH，Met和NAC對乙醇脅迫的釀酒酵母生長的恢復(fù)作用。 取經(jīng)不同化合物處理1h后的對數(shù)期釀酒酵母，涂有不同濃度梯度酵母細(xì)胞的YPD固體平板于30176。與CK相比，P ：差異顯著(*)，P ：差異極顯著(**) 。將培養(yǎng)至對數(shù)期的酵母分別在含H2O、10% ethanol、10% ethanol+ mM GSH、10% ethanol+6 mM Met、10% ethanol+10 mM NAC的YPD培養(yǎng)基中生長一定時間。培養(yǎng)至對數(shù)期的酵母分別在含H2O、10% ethanol、10% ethanol + mM GSH、10% ethanol a+6 mM Met、10% ethanol + 10 mM NAC的YPD培養(yǎng)基中生長一定時間，PI染色檢測其熒光值。使用SPSS進(jìn)行T檢驗(yàn)，與CK相比，P ：差異顯著(*)，P ：差異極顯著(**) 。在乙醇存在時，同時加入GSH、Met和NAC處理15 min后，前兩種物質(zhì)并沒使乙醇導(dǎo)致增加的紅色熒光有明顯變化，而NAC明顯降低了紅色熒光的強(qiáng)度。Rh123可透過細(xì)胞膜且在活細(xì)胞的線粒體內(nèi)聚集，并發(fā)出黃綠色熒光，當(dāng)線粒體膜電位降低時，Rh123被重新釋放出線粒體導(dǎo)致熒光降低。培養(yǎng)至對數(shù)期的酵母分別在含H2O、10% ethanol、10% ethanol + mM GSH、10% ethanol a+6 mM Met、10% ethanol + 10 mM NAC的YPD培養(yǎng)基中生長1h，Rh123染色30 min檢測其熒光值。與10%E相比，P ：差異顯著()，P ：差異極顯著()。活性氧的種類不同，其起作用的方式也不同，本實(shí)驗(yàn)分別以熒光染料DHE和DCFHDA為探針，測定了不同處理酵母中的O2熒光顯微鏡所拍照片(A)。使用SPSS進(jìn)行T檢驗(yàn)，與CK相比，t ：差異顯著(*)，t ：差異極顯著(**) ；與10%E相比，t ：差異顯著()，t ：差異極顯著()。乙醇可以明顯提高DHE染色后細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，分別加入GSH、Met和NAC后發(fā)現(xiàn)三種化合物都可以降低乙醇增加的紅色熒光強(qiáng)度，進(jìn)一步用熒光酶標(biāo)儀驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)GSH、Met 和NAC確實(shí)可以非常明顯的降低乙醇增加的紅色熒光強(qiáng)度，但是仍比對照組的水平要高。 GSH，Met和NAC對乙醇脅迫釀酒酵母細(xì)胞O2含量的影響。所有值均為三次平行實(shí)驗(yàn)的平均值177。. Effects of GSH、Met and NAC on the O2 level of cells under ethanol stress. Cell were grown in YPD medium until midlog phase and treated with indicated reagents for 1 h. A）Cells were stained with NBT, micrographs of the cells were taken under a microscope. B) Cells were stained with NBT, the relative intensity were measured by a microplate reader. CK: control, 10%E: 10% ethanol, 10%E+GSH: 10% ethanol and mM GSH, 10%E+Met: 10% ethanol and 6 mM Met, 10%E+NAC: 10% ethanol and 10 mM NAC. Each rectangle represents the mean 177。進(jìn)一步用NBT法驗(yàn)證GSH、Met和NAC對乙醇脅迫的釀酒酵母中O2兩種方法結(jié)果不一致，有可能是因?yàn)镈CFHDA和NBT對O2熒光顯微鏡下拍照，A：15 min，B：30 min，C：60 min。與10%E相比，t ：差異顯著()，t ：差異極顯著()。熒光染料DCFHDA（2’，7’二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉）可以自由穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在胞內(nèi)非特異性脂酶的催化下，變成DCFH (2’，7’二氫二氯熒光黃)，DCFHDA本身并不能發(fā)出熒光。在乙醇存在時分別加GSH，Met和NAC的三組處理在15 min，30 min時熒光強(qiáng)度與單獨(dú)的乙醇處理組沒有明顯差別，而在60 min時三者明顯降低了熒光強(qiáng)度。 GSH，Met和NAC對乙醇脅迫釀酒酵母MDA含量的影響。使用SPSS進(jìn)行T檢驗(yàn)，與CK相比，t ：差異顯著(*)，P ：差異極顯著(**) 。培養(yǎng)至對數(shù)期的酵母分別在含H2O、 mM GSH、6 mM Met、10 mM NAC的發(fā)酵培養(yǎng)基中生長72 h，蒸餾后采用密度瓶法檢測酒精濃度。. Effects of GSH、Met and NAC on the ethanol yield of cells under ethanol stress. Cell were grown in fermentation medium until midlog phase and treated with indicated reagents for 72