克東腐乳發(fā)酵生產(chǎn)中優(yōu)勢(shì)菌株細(xì)胞融合方法初探畢業(yè)論文-預(yù)覽頁(yè)
【正文】 ………………………………………14 生長(zhǎng)曲線測(cè)定…………………………………………………………14 抗藥性標(biāo)記……………………………………………………15 原生質(zhì)體制備條件優(yōu)化…………………………15 ………………………………………………………………16 ……………………………17 ………………………………………………………………18 …………………………………18 ……………………………19 ……………………………………19 …………………………………21第 3 章 結(jié)果與討論 …………………………………………………………………23 生長(zhǎng)曲線測(cè)定及細(xì)菌培養(yǎng) …………………………………………23 抗藥性標(biāo)記結(jié)果 ……………………………………………………………27 原生質(zhì)體制備條件的優(yōu)化結(jié)果 ………………………結(jié)論 …………………………………………………………………………………38參考文獻(xiàn) ……………………………………………………………………………39附錄 …………………………………………………………………………………41致謝 …………………………………………………………………………………49第 1 章 緒 論 課題背景腐乳是我國(guó)的傳統(tǒng)豆制發(fā)酵食品．在我國(guó)有 1000 多年的歷史。產(chǎn)品亦有健脾補(bǔ)陽(yáng)、溫中散寒、解膻去膩、幫助消化等功能，是國(guó)內(nèi)唯一特許的中草藥配方的腐乳。細(xì)菌型特點(diǎn)為前期發(fā)酵使用細(xì)菌 ，根據(jù)生產(chǎn)用菌可分為微球菌腐乳和枯草桿菌腐乳。 研究近況 國(guó)內(nèi)研究現(xiàn)狀腐乳在我國(guó)已有一千多年的歷史，其制作工藝及產(chǎn)品風(fēng)味各具地方特色，是一種非常大眾化的食品。目前，國(guó)內(nèi)外許多重要的抗生素都是通過(guò)原生質(zhì)體融合技術(shù)來(lái)提高其產(chǎn)量的。然而近年來(lái),隨著大豆育種技術(shù)和食物生產(chǎn)水平的提高,無(wú)豆腥味大豆制品得到普遍發(fā)展,加上傳統(tǒng)大豆制品食用方便,含有豐富的蛋白質(zhì)和鈣,并且其中也富含大豆中的特殊功能保健因子,因此傳統(tǒng)大豆制品如豆腐、腐乳等也受到西方發(fā)達(dá)國(guó)家居民的廣泛歡迎,消費(fèi)量在逐年升高。例如日本味之素公司應(yīng)用細(xì)胞融合技術(shù)使產(chǎn)生氨基酸的短桿菌雜交，獲得比原產(chǎn)量高 3 倍的賴氨酸產(chǎn)生菌和蘇氨酸高產(chǎn)新菌株然而目前為止國(guó)外對(duì)腐乳中菌類的研究依然比較少，大部分研究都集中在生產(chǎn)工藝的改進(jìn)上。 抗藥性標(biāo)記 配制培養(yǎng)基配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(培養(yǎng)細(xì)菌用)，將青霉素、鏈霉素、紅霉素、白霉素、卡那霉素、氯霉素、慶大霉素、利福平、螺旋霉素和土霉素 10 種抗生素分別按20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL 、120μg/mL 、140μg/mL、180μg/mL、220μg/mL 、240μg/mL、260μg/mL 的終濃度加入到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中； 滅菌將所配培養(yǎng)基與所需的平板在 121℃下滅菌 30 min； 倒平板當(dāng)培養(yǎng)基的溫度達(dá)到不燙手（40～50℃）時(shí)，將培養(yǎng)基倒平板，等待平板逐漸冷卻凝固，待用； 接菌將 QSG 和 QSY 的菌懸液接入培養(yǎng)基中，涂布均勻； 培養(yǎng)將細(xì)菌平板放置 37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24～48h，平板要倒置培養(yǎng)。例如處于穩(wěn)定期和衰老期的菌體，則由于菌體老化，生理活性低，故利用此期間的菌體所制備出來(lái)的原生質(zhì)體活性也低，再生能力也很差。 抗藥性標(biāo)記結(jié)果表 31 菌體對(duì)青霉素（Penicillin ） 的抗性（μg/mL）CK 20 40 80 120 140 180 220 260綠菌QSG﹢ ﹢ ﹣ ﹣ ﹣ ﹣ ﹣ ﹣ ﹣黃菌QSY﹢ ﹢ ﹢ ﹢ ﹢ ﹢ ﹢ ﹢ ﹣+ ：生長(zhǎng) ﹣ ：不生長(zhǎng)表 32 菌體對(duì)鏈霉素（Streptomycin）的抗性（μg/mL ）CK 20 40 80 120 140 180 220 260綠菌QSG﹢ ﹢ ﹢ ﹢ ﹢ ﹢ ﹢ ﹢ ﹢黃菌QSY﹢ ﹢ ﹢ ﹢ ﹢ ﹣ ﹣ ﹣ ﹣+ ：生長(zhǎng) ﹣ ：不生長(zhǎng)表 33 菌體對(duì)紅霉素（Erythromycin）的抗性（ μg/mL）CK 20 40 80 120綠菌 QSG ﹢ ﹢ ﹣ ﹣ ﹣黃菌 QSY ﹢ ﹣ ﹣ ﹣ ﹣+ ：生長(zhǎng) ﹣ ：不生長(zhǎng)分析：由表 表 表 3 可見(jiàn)，供試菌株對(duì)不同濃度的青霉素、鏈霉素和紅霉素3 種抗生素表現(xiàn)出不同的抗性。根據(jù)鑒定結(jié)果，40μg/mL 的青霉素和 140μg/mL 的鏈霉素可分別作為QSG 和 QSY 的抗藥性標(biāo)記。 溶菌酶水解溫度的優(yōu)化取第 2 代 QSG 菌，菌齡為 16h 的菌液制備原生質(zhì)體，使用 3mg/mL 的溶菌酶，酶解時(shí)間為 60min，作用不同溫度，原生質(zhì)體的形成率與再生率見(jiàn)表 36。在水解 pH 值為 時(shí)，原生質(zhì)體再生率最高。表 39 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體形成率與再生率的影響作用時(shí)間（min）A(個(gè)) B(個(gè)) C(個(gè)) 形成率（％）再生率（％）306090120403024504030403065232211813108204020分析：由表 35 可見(jiàn)，隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，原生質(zhì)體的形成率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，再生率呈下降趨勢(shì)，酶解時(shí)間超過(guò) 90min，原生質(zhì)體的形成率開(kāi)始下降，再生率也明顯降低。表 311 酶解 pH 值對(duì)原生質(zhì)體形成率從與再生率的影響水解 pH A(個(gè)) B(個(gè)) C(個(gè)) 形成率（％）再生率（％） 3810 221 1100 4410 301 1880 3810 6 3810 2 分析：由表 311 可見(jiàn)，水解 pH 值在 和 的條件下，再生培養(yǎng)基上沒(méi)有長(zhǎng)出菌落。其次，融合后的原生質(zhì)體必須順利地再生出細(xì)胞壁，進(jìn)而形成完整的營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞，才可能順利地篩選出穩(wěn)定的高產(chǎn)重組子。酶量過(guò)大和酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)降低再生率的原因，可能第一是由于原生質(zhì)體脫壁太徹底，失去了再生的細(xì)胞殘壁引物而難于再生；第二是由于原生質(zhì)體受酶的毒性作用，而失活或減少活性，因而再生率明顯下降。結(jié) 論本試驗(yàn)結(jié)果表明：克東腐乳中的兩種藤黃微球菌可以通過(guò)細(xì)胞融合得到新的原生質(zhì)體，具有兩種藤黃微球菌的部分特性，并可以通過(guò)抗藥性標(biāo)記將其分離。我要感謝實(shí)驗(yàn)室中的鄭義學(xué)長(zhǎng)、劉文麗學(xué)姐、鄭宏臣學(xué)長(zhǎng)、時(shí)晰學(xué)長(zhǎng)，在我的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，給予的幫助和支持，特別是鄭義學(xué)長(zhǎng)，我的實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蝽樌_(kāi)展和進(jìn)行，學(xué)長(zhǎng)在實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)器材方面給了我很大的幫助，并指導(dǎo)了我相關(guān)儀器的使用和維
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