啤酒酵母ecm25yjl201w基因敲除對(duì)啤酒風(fēng)味穩(wěn)定性的影-預(yù)覽頁(yè)
【正文】 03/a increased by % and %, respectively. Strains G03 and G03/a were inoculated in flasks and cultivated continuously for 4 generations. Compared with the host strain G03, the glutathione concentration in the main fermentation broth and final beer of strain G03/a increased by % and %, the stability index (SI) increased by % and %, respectively, and the flavor resistance staling value (RSV value) in final beer increased by %. During EBC fermentation, the glutathione concentration in the main fermentation broth of strain G03/a increased by %, pared with the host strain G03. Furthermore, no significant difference in routine fermentation parameters was found. The strain G03/a is proved to be an excellent antistaling brewing yeast to improve beer flavor stability.Keywords: brewing yeast, gene knockout, ECM25, glutathione, excretion, beer flavor stability1427 / 8風(fēng)味穩(wěn)定性作為啤酒的重要質(zhì)量指標(biāo)之一, 從20世紀(jì)70年代開始就受到國(guó)外學(xué)者的關(guān)注[1,2]。在錐形瓶中連續(xù)發(fā)酵4代后, 與原菌株相比, 轉(zhuǎn)化菌G03/a發(fā)酵液、%%, %%, %。有氧條件下11oC和28oC培養(yǎng)時(shí)轉(zhuǎn)化菌G03/a的胞外谷胱甘肽(GSH)%%。表明G03/a是一株具有抗老化能力的優(yōu)良啤酒酵母, 能夠提高啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性。但是啤酒酵母會(huì)產(chǎn)生一些具有抗老化功能的還原性物質(zhì), 如還原型谷胱甘肽(GSH)、亞硫酸鹽和還原酮等, 它們都能協(xié)助消除氧自由基的積累。啤酒生產(chǎn)時(shí)酵母合成和分泌的GSH可以顯著延長(zhǎng)啤酒的風(fēng)味保鮮期[1012]。質(zhì)粒pMD18T購(gòu)自TaKaRa公司。引物由上海生工合成(表1)。YPD培養(yǎng)基: 酵母粉10 g/L, 蛋白胨20 g/L, 葡萄糖20 g/L。 72oC, 12 min。表1 PCR介導(dǎo)基因破壞引物和驗(yàn)證引物Table 1 Oligo nucleotides used in PCRmediated gene disruption and verificationPrimersSequence (5′→3′)For gene knock outPecout01TCGACTTATTTGCCAGCATCTGATGAAATTGGCGATAGGTCGACAACCCTTAATATAACPecout02TAGCCTGCTAACCTTGTTGCTTGCTTTAATATCTGGTGGATCTGATATCACCTAATAACFor PCR verificationPkanT02TTCCATAGGATGGCAAGATCPecmT02TCTTTGTGGACTAGGGCTTCPecm01ATGATAGATATCAACGTTAATAACPecm02TTACCACCTTTGTTTCATTTCATTC 啤酒酵母感受態(tài)的制備、轉(zhuǎn)化及篩選啤酒酵母感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化見(jiàn)文獻(xiàn)[13]。 72oC, 12 min。將第3代、5代、7代、10代轉(zhuǎn)化菌接種于YPD液體培養(yǎng)基, 180 r/min培養(yǎng)1 d, 收集細(xì)胞, 提取基因組DNA, 以酵母基因組DNA為模板, PCR驗(yàn)證。 發(fā)酵液中GSH濃度四氧嘧啶法測(cè)定發(fā)酵液中的GSH[14]。以5 mL離心后麥汁或啤酒樣品加2 mL蒸餾水為空白, 530 nm下比色, 以吸光度表示TBA值。 Aj: 2 mL待測(cè)液加2 mL無(wú)水乙醇的吸光度。ESR測(cè)定條件: G。 G。C水浴中陳化, 每12 h取出1瓶陳化啤酒放于冰箱中保存。2 結(jié)果與分析 ECM25的克隆和序列分析提取G03染色體組DNA, 用Pecm01和Pecm02擴(kuò)增出ECM25, 膠回收后連接pMD18T, 送上海生工測(cè)序, kb(GenBank Accession No. EU328157)。PCR產(chǎn)物1649 bp(圖1), 與預(yù)計(jì)片段大小相符。將在G418抗性平板上生長(zhǎng)出的菌落劃線分離, 獲得單菌落命名為G03/a。 1: PCR product of G03。結(jié)果表明, 原菌內(nèi)部沒(méi)有抗性基因(Lane3), 轉(zhuǎn)化菌內(nèi)部具有抗性基因(Lane 4), 由于工業(yè)啤酒酵母為多倍體, 轉(zhuǎn)化菌可能只敲除了多倍體酵母中的一個(gè)ECM25等位基因 (Lane 2), 可能至少還有一個(gè)完整的ECM25基因。將移接10次的轉(zhuǎn)化菌在含200 mg/L G418的YPD平板上劃線(圖5), 表明其遺傳穩(wěn)定性良好。這是因?yàn)槠【平湍冈?8oC下生長(zhǎng)代謝旺盛, 雖然在遲滯期胞外GSH含量較高, 但是一些老化物質(zhì)的前驅(qū)物質(zhì)的產(chǎn)生能力和氧自由基得到加強(qiáng), 導(dǎo)致對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期胞外GSH含量較低。 ○: G03/a。 ■G03/a。Coulon也報(bào)道過(guò)在Kluyveromyces lactis酵母中谷胱甘肽的代謝和絮凝之間存在著潛在的關(guān)系, 即谷胱甘肽含量高者, 酵母的絮凝值會(huì)降低[20]。Kodama等人發(fā)現(xiàn), a氨基氮同化率和纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸有著密切的聯(lián)系, 同時(shí), 異亮氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸和細(xì)胞膜流動(dòng)性或穩(wěn)定性相關(guān)[21]。主發(fā)酵結(jié)束后, 稱取酵母泥進(jìn)行下一次發(fā)酵, 為1代。 SD, n=3)StrainG03MI4G03/aLethality temperature (oC)535252Flocculation value (%)177。177。177。177。Fermentation degree (%)177。轉(zhuǎn)化菌G03/% (P)% (表4)。% (P), 比G03/%, G03/% (P) (表4)。這也表明, 胞內(nèi)合成GSH能力強(qiáng)的啤酒酵母可能比分泌型啤酒酵母對(duì)啤酒風(fēng)味穩(wěn)定性有更高的貢獻(xiàn)。圖9顯示, 隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行, 胞內(nèi)GSH含量逐步增加并恒定, 發(fā)酵液中GSH含量逐步減少。 SD, n=3)StrainG03MI4G03/aSI of fresh beer2177。177。177。RSV of final beer3177。 △: MI4。 ●: Extracellular GSH content of G03。但是用于基因破壞的kanMX對(duì)于啤酒酵母是一個(gè)外源基因, 因此轉(zhuǎn)化菌還需要對(duì)其進(jìn)行敲除才可以用于實(shí)際生
環(huán)評(píng)公示相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1