【正文】 f nonessential genes required for slowed DNA synthesisinduced filamentous growth in yeast. Yeast, 2005, 22: 79 90.[6] Gavin AC, B246。177。經(jīng)品嘗, 轉(zhuǎn)化菌G03/a與啤酒酵母G03釀制的啤酒風(fēng)味基本一致。177。測試各項(xiàng)發(fā)酵性能指標(biāo)(表3), 常規(guī)指標(biāo)沒有顯著變化(P)。 B: propagate temperature 28oC。 3~6: PCR products of G03/a 由于轉(zhuǎn)化菌G03/a在G418抗性平板上生長, 說明至少有一個ECM25等位基因已經(jīng)被kanMX替代, 而原菌G03具有完整的ECM25。風(fēng)味保鮮程度(Resistance staling value , RSV)以下式表示[18]不同新鮮啤酒樣品的RSV值與啤酒的風(fēng)味保鮮期基本呈線性關(guān)系。測定: 樣品稀釋20倍后取2 mL待測液及2 mL DPPH溶液置于一具塞試管中, 混勻, 30oC水浴避光放置60 min, 以無水乙醇為空白于517 nm測其吸光度Ai, 并以下式計(jì)算清除率[16]:式中: Ac: 2 mL無水乙醇加2 mL DPPH溶液的吸光度。 基因組DNA提取及轉(zhuǎn)化菌的鑒定基因組DNA的提取見文獻(xiàn)[13], 使用表1的引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證, PCR循環(huán)參數(shù)為: 94oC, 5 min。 主要試劑2苯叔丁基硝酮(PBN 純度為98%), 聚乙二醇3350 (PEG 3350), 單鏈載體DNA(來自沙門氏試驗(yàn)中Ⅲ型脫氧核酸鈉鹽)均購自Sigma公司。EBC管發(fā)酵6 d后, 與原菌株相比, 轉(zhuǎn)化菌G03/%。Perrone等已經(jīng)發(fā)現(xiàn), 酵母ECM25基因的缺失, 或液泡蛋白質(zhì)分選等基因的缺失, 會影響GSH的運(yùn)輸途徑, 從而改變GSH的內(nèi)穩(wěn)態(tài)并導(dǎo)致其過量分泌[79], 但是這些菌株通常只是用于實(shí)驗(yàn)室研究的營養(yǎng)缺陷型, 而工業(yè)啤酒酵母是野生型菌株, 且沒有關(guān)于工業(yè)啤酒酵母ECM25基因缺失和胞外分泌GSH的報(bào)道。 30個循環(huán): 94oC, 40 s, 56oC, 90 s, 72oC, 2 min。第1天 10oC, 2~6 天 11oC主發(fā)酵, 每天取樣測定發(fā)酵液中GSH及酵母胞內(nèi)GSH。 調(diào)制頻率200 kHz。使該基因片段的兩端與ECM25發(fā)生同源重組, 從而達(dá)到破壞ECM25的目的(圖2)?？梢钥闯? 和原菌相比, 在11oC下轉(zhuǎn)化菌G03/a在對數(shù)生長期中期( h)% (P), 在28oC下轉(zhuǎn)化菌在對數(shù)生長期中期(7 h)% (P)。而BCAAs在釀造過程中是轉(zhuǎn)化成高級醇的關(guān)鍵。 SD, n=3)StrainG03MI4G03/aOriginal extract (W/W, %)177。與原菌G03曲線相比, G03/a的曲線上升趨勢先慢后快, 表明主酵液中存在快速的還原劑, 這可能是由于GSH與自由基發(fā)生反應(yīng), 使得在培育初期的自由基清除, 而MI4所釀制的主酵液中存在作用緩慢的抗氧化劑, 可能是由于其胞內(nèi)GSH在培育后期釋放而使得曲線后期近零增長。Extracellular GSHof fresh beer2177。 ■: Intracellular GSH content of MI4。 ○: Extracellular GSH content of G03/a。177。成品啤酒中G03/% (P), % (P)。177。所以, 氨基酸代謝和谷胱甘肽的胞外積累有著千絲萬縷的關(guān)系。通過蛋氨酸連續(xù)馴養(yǎng)得到的GSH合成能力提高的MI4 (圖7), 胞外GSH含量在對數(shù)生長期卻沒有轉(zhuǎn)化菌G03/a高, 這表明, ECM25基因的圖6 在11oC和28oC下啤酒酵母有氧生長的胞外GSH含量Fig. 6 The extracellular GSH content of brewing yeast under different tempraturesA: propagate temperature 11oC。 轉(zhuǎn)化菌的驗(yàn)證及遺傳穩(wěn)定性轉(zhuǎn)化子DNA水平上的鑒定先采用PCR來驗(yàn)證。 溫度室溫。 酵母胞內(nèi)GSH含量先將酵母細(xì)胞用蒸餾水洗滌2次后置于20oC冷凍后煮沸15 min, 然后在濃度為40%(V/V)的乙醇溶液中30oC下振蕩抽提2 h, 測定上清液GSH濃度, 除以相應(yīng)細(xì)胞干重得到胞內(nèi)GSH含量。 4oC保溫。本次研究主要是對一株工業(yè)啤酒酵母(Saccharomyces carlsbergensis)G03通過同源重組, 以卡那抗性基因替換, 敲除ECM25基因, 獲得了一株GSH分泌量增加的抗老化啤酒酵母菌株G03/a。有氧條件下11oC和28oC培養(yǎng)時轉(zhuǎn)化菌G03/a的胞外谷胱甘肽(GSH)%%。質(zhì)粒pMD18T購自TaKaRa公司。表1 PCR介導(dǎo)基因破壞引物和驗(yàn)證引物Table 1 Oligo nucleotides used in PCRmediated gene disruption and verificationPrimersSequence (5′→3′)For gene knock outPecout01TCGACTTATTTGCCAGCATCTGATGAAATTGGCGATAGGTCGACAACCCTTAATATAACPecout02TAGCCTGCTAACCTTGTTGCTTGCTTTAATATCTGGTGGATCTGATATCACCTAATAACFor PCR verificationPkanT02TTCCATAGGATGGCAAGATCPecmT02TCTTTGTGGACTAGGGCTTCPecm01ATGATAGATATCAACGTTAATAACPecm02TTACCACCTTTGTTTCATTTCATTC 啤酒酵母感受態(tài)的制備、轉(zhuǎn)化及篩選啤酒酵母感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化見文獻(xiàn)[13]。以5 mL離心后麥汁或啤酒樣品加2 mL蒸餾水為空白, 530 nm下比色, 以吸光度表示TBA值。C水浴中陳化, 每12 h取出1瓶陳化啤酒放于冰箱中保存。 1: PCR product of G03。 ○: G03/a。主發(fā)酵結(jié)束后, 稱取酵母泥進(jìn)行下一次發(fā)酵, 為1代。177。這也表明, 胞內(nèi)合成GSH能力強(qiáng)的啤酒酵母可能比分泌型啤酒酵母對啤酒風(fēng)味穩(wěn)定性有更高的貢獻(xiàn)。177。但是用于基因破壞的kanMX對于啤酒酵母是一個外源基因, 因此轉(zhuǎn)化菌還需要對其進(jìn)行敲除才可以用于實(shí)際生產(chǎn)。 △: MI4。 SD, n=3)StrainG03MI4G03/aSI of fresh beer2177。轉(zhuǎn)化菌G03/% (P)% (表4)。177。Coulon也報(bào)道過在Kluyveromyces lactis酵母中谷胱甘肽的代謝和絮凝之間存在著潛在的關(guān)系, 即谷胱甘肽含量高者, 酵母的絮凝值會降低[20]。將移接10次的轉(zhuǎn)化菌在含200 mg/L G418的YPD平板上劃線(圖5), 表明其遺傳穩(wěn)定性良好。PCR產(chǎn)物1649 bp(圖1), 與預(yù)計(jì)片段大小相符。ESR測定條件: G。將第3代、5代、7代、10代轉(zhuǎn)化菌接種于YPD液體培養(yǎng)基, 180 r/min培養(yǎng)1