【正文】 慢性冠狀動(dòng)脈閉塞、心肌缺血或觀察冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)的變化，用具有吸水性的塑料環(huán) (Ameroid環(huán) )套在冠狀動(dòng)脈左旋支根部。實(shí)驗(yàn)時(shí)注入蒸餾水，使氣囊膨脹，壓迫冠狀動(dòng)脈造成心肌缺血，測量心外膜電圖或其他觀察指標(biāo) ,本法可反復(fù)阻斷冠狀動(dòng)脈，進(jìn)行多次清醒動(dòng)物的心肌缺血實(shí)驗(yàn)及再灌注損傷實(shí)驗(yàn)?；蛴靡粋€(gè)電極沿心表山一定途徑移，記出一個(gè)連續(xù)的心外膜電曲線。 (2)缺血區(qū)及梗死區(qū)面積的測定：在阻斷冠狀動(dòng)脈血流孔后，經(jīng)左心耳根部向心房注人碳索墨水 1． 5ml／ kg， 2030s注完，迅速取下心臟，冰凍 30— 40min，在冠狀動(dòng)脈結(jié)扎線下．平行冠狀溝等厚度將心室部分橫切成 5片，分別稱重，再用求積儀或電腦圖分析儀測量每片心肌兩面的墨水染色區(qū)與末染區(qū) (缺血區(qū) )，計(jì)算心肌缺血范圍的重量及百分比。 同時(shí)可測定血 ATP、 cAMP／ cGMP、無機(jī)離子、代謝物、能量代謝物質(zhì)等，如需了解藥物作用與前列腺素的關(guān)系，可觀察 PGl2或代謝產(chǎn)物的變化，以觀察藥物對(duì)的影響。 (2)正式實(shí)驗(yàn)之前應(yīng)熟練掌握動(dòng)物開胸手術(shù)和冠狀動(dòng)脈分離手術(shù)，盡量減少出血，做心包床時(shí)，心肌不應(yīng)移位而影響心臟的正常舒縮功能。否則將影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。 (二 )大鼠實(shí)驗(yàn)性心肌梗死模型 I，原理 結(jié)扎大鼠的冠狀動(dòng)脈前降支，阻斷其分布區(qū)域的心肌供血，心肌細(xì)胞長時(shí)間缺血缺氧而造成不可逆損傷和壞死。 (2)測定血漿生化指標(biāo)：如 IDH、 CPK、 ATP、 cAMP／ cGMP、 PGI2／TXA2等。手術(shù)者必須熟悉冠狀動(dòng)脈的分布和解削位置，便于定位。在藥效學(xué)研究可根據(jù)所試藥物的藥理作用及作用特點(diǎn)，選用不同的動(dòng)物和模型。 (2)離體心臟缺血再灌注損傷模型：實(shí)驗(yàn)一般用成年 Wistar種雄性大鼠，猛擊動(dòng)物頭部使昏迷，快速開胸，摘取心臟、立即放人 4℃ 改良 KrebsHensleit液中，主動(dòng)脈插管，裝于 Leaigendorff罐流裝置，以K— H液 (pH7． 4)恒溫 37℃ 進(jìn)行灌流。③復(fù)灌期，剪斷結(jié)扎線，進(jìn)行再灌注 15min。心肌梗死面積測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將心臟橫切染色，計(jì)算心肌梗死面積。在攪拌器上 37℃ 水浴消化 10min．自然沉淀后，丟上消液，沉淀的組織塊再加入胰蛋白酶，消化 l0min，然后吹打 1min，自然沉淀，上清移人離心骨中。 體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧缺糖性損傷模型的建立方法：取培養(yǎng) 3日的心肌細(xì)胞，按下法進(jìn)行缺氧缺糖實(shí)驗(yàn)．①缺糖：實(shí)驗(yàn)時(shí)采用無糖液或不含糖的 Eagle培養(yǎng)基代替正常培養(yǎng)。 3．測定指標(biāo) (1)形態(tài)學(xué)觀察：用臺(tái)盼蘭染色進(jìn)行死活細(xì)胞鑒定，觀察細(xì)胞活力的改變及死亡比例，光學(xué)顯微鏡下可觀測心肌細(xì)胞形態(tài)變化，如偽足變化、胞泡形成、胞漿顆粒增加、異形 (長形、紡錘形 )心肌細(xì)胞的出現(xiàn)。 (4)其他：測定細(xì)胞內(nèi)氧化物歧化酶的變化從鈣離子運(yùn)轉(zhuǎn)等。③適用于從細(xì)胞或分子水平進(jìn)行機(jī)制研究。 (五 )藥物誘發(fā)心肌缺血模型 近年研究認(rèn)為冠狀動(dòng)脈痙攣是導(dǎo)致心肌急性缺血的主要原因之 — ．致心絞痛、心肌梗死和猝死。實(shí)驗(yàn)前有心電圖或心律失常異常變化，則棄去不用，根據(jù)所試藥物特點(diǎn)選擇適當(dāng)給藥途徑和間隔，靜脈給后 1— 5min腹腔注射后 15— 30min，灌胃后 12h，經(jīng)下靜脈或尾靜脈注射垂體后葉素 0． 5或 0． 7u／ kg，注射速度 5s或 l0s。 判定標(biāo)準(zhǔn)，以出現(xiàn)第一期或第二期缺血變化為陽性，否則為陰性，比較各組的差異，并做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。適用調(diào)節(jié)心肌代謝、氧供需平衡及作用于受體藥物的研究； (2)方法：健康大鼠、小鼠、豚鼠、家兔、貓或犬均可。心肌病理觀察可見：白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤，心肌纖維腫脹、斷裂、橫 紋消失、甚至溶解，發(fā)生玻璃樣變和脂肪變性等。這種動(dòng)物模型 可用以評(píng)價(jià)通過緩解冠狀動(dòng)脈痙攣、攻善血液流變性等多種途徑．防治心肌缺血的藥物。生化指標(biāo)： CPK、血小板聚集、 TXB kelo— PGF等變化。為簡化實(shí)驗(yàn)方法，可試用貓、兔、大鼠或豚鼠 按照垂體后葉素實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。 2．方法 健康犬或小型堵，雌雄兼用，體重 1215kg實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用戊巴比妥鈉 (30mg／ kg) 靜脈麻酐，手術(shù)臺(tái)固定，分離氣管并插管，連接電動(dòng)呼吸機(jī)，調(diào)節(jié)潮氣量300— 600ml，動(dòng)脈氧 分壓維持在如 — 100mmHg，血 ph在正常范圍；左側(cè)第四肋開胸，露心臟，剪開心包，做 心包床：分離冠狀動(dòng)脈左旋及主動(dòng)脈根部。股動(dòng)脈插管測定動(dòng)脈血壓，以肢體導(dǎo)聯(lián)觀測標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)心電圖并計(jì)算心率。、實(shí)驗(yàn)人員要經(jīng)過嚴(yán)格訓(xùn)練，盡量減少對(duì)心肌功能的影響。研究中，應(yīng)以多種指標(biāo)綜合分析，了解平衡兩方面的變化，特別是凈效應(yīng)，才能獲得準(zhǔn)確的結(jié)論。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物開胸完成后，分離冠狀動(dòng)脈左旋支，放置適宜電磁流量探頭，測量冠脈血流量．測定動(dòng)脈血壓。在冠脈左前降支下 1／ 3處，分離并結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，于遠(yuǎn)端插入冠脈插管。分離股動(dòng)脈，插入動(dòng)脈管，記錄動(dòng)脈血壓。 (2)冠狀靜脈竇血流量測定：通過測量冠狀靜脈竇血流量，反映冠脈血流量的變化，約 60％的冠脈血經(jīng)冠脈竇流入右心房。為尋找治療冠心病藥物，觀測心肌營養(yǎng)性血流量及冠脈總血流兩者配合更有意義。然后將心臟置玻璃研缽內(nèi)．磨成勻漿，放特制鋁箔小皿內(nèi)，在普通燈下烘干，用射線自動(dòng)標(biāo)器計(jì)數(shù)。③每只動(dòng)物取心臟時(shí)所用剪刀、鑷子齊用 — 套．以防不同動(dòng)物間相干擾。用多導(dǎo)Y能諾分析儀記心肌與參考血樣品的放射。 (5)離體心臟冠脈灌流法：哺乳動(dòng)物離體心臟，插管人動(dòng)脈灌流肘，灌流液須經(jīng)冠狀動(dòng)脈經(jīng)右心房流出心臟，故流出量可代表冠脈流量，在灌注壓不變的條件下，其流量可反映冠脈阻力的變化。灌注約 15rain后，連續(xù)測定每分鐘冠脈流量 3次：待恒定后開始給藥，／ H量筒收集流出記錄給藥前后及給藥后每 lmin流出量。灌流液必須用新鮮蒸餾水臨時(shí)配制。用 6V直流電產(chǎn)生的斷續(xù)感應(yīng)電震直接刺激心臟，或用方形波刺激器刺激，也用交流電刺激引起心纖顫，然后測定每 lmin冠脈流量的變化。心肌氧代謝的研究方法約分為三類。心肌缺血時(shí)內(nèi)膜下血流及氧張力下降甚于心外股，缺血什損傷及壞死也較外層心肌嚴(yán)重，因此，用雙暴露電極測定左心室外／內(nèi)膜下氧張力變化以研究藥物的影響，更有意義。或測氧儀直接測定心肌片的耗氧量。 ③正性肌力作用 ，心肌收縮力、心肌縮短速度與心肌耗氧呈線形關(guān)系，凡有正性肌力作用或延長射血時(shí)間者，均增加心肌耗氧量，可根據(jù)藥物指標(biāo)的影響推測心肌耗氧量的變化。實(shí)驗(yàn)方法較前者復(fù)雜，但可獲得較多信息，對(duì)藥物研究有 — 定實(shí)用價(jià)值。用小鼠或大鼠測定速度、存活時(shí)間及死亡時(shí)余存氧含量，可以較準(zhǔn)確的反映出整體動(dòng)物的耗氧速度及藥物的影響，較前者精細(xì)，但亦不能直接說明心肌的耐氧能力，耗氧速度。測定動(dòng)脈血，冠狀靜脈或缺血區(qū)血液乳酸或鉀的含量，較心電圖及血流動(dòng)力學(xué)更敏感的反映心肌缺氧程度及藥物的影響?？膳c實(shí)驗(yàn)中同時(shí)測定的其他血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)如冠脈血流量、血壓、心電圖等連續(xù)描記于生理記錄儀，進(jìn)行比較研究。取血量要適度，避免抽取血量過多而造成缺血。再經(jīng) — 定時(shí)間后處死動(dòng)物，取心肌梗死區(qū)及對(duì)照區(qū)心肌組織，于冰浴上切、稱重，加入心肌孵液，于 37℃ 恒溫水浴平衡，然后將孵育液注入測氧儀，測氧分壓，孵育前后的氧分壓差值即為該組織的耗氧值。然后每瓶放人一只小鼠，各組動(dòng)物分別給生理鹽水或藥物?；蛴醚b有氧電極的橡皮塞塞緊瓶，使氧電極與瓶內(nèi)氣體接觸，連接測氧儀，可測出瓶內(nèi)氧量變化，反映耗氧速度。厥證是指邪熱內(nèi)陷或陰寒內(nèi)盛所致的四肢逆冷病證。厥脫各證互相轉(zhuǎn)化，熱厥證外感溫?zé)岵?，熱毒?nèi)陷．高熱致厥，進(jìn)一步發(fā)展，熱毒熾盛、內(nèi)攻臟腑、陰液大耗而致陰脫證，也可熱傷氣陰，陰陽離決，陽氣暴脫而致陽脫證。引起的原因多種．如久血性、感染性、心源性、創(chuàng)傷性，過敏嚴(yán)重性休克等。 (2)感染性休克模型：用活菌、內(nèi)毒素或膿毒病灶復(fù)制感染性休克模型，可選用小鼠、大鼠，兔、貓，犬等。常用動(dòng)物有小鼠、兔、貓等?？蛇x大鼠、免等。 3．方法學(xué)評(píng)價(jià) 上述各種方法造成的模型，可根據(jù)新藥的主治和功效選。 (二 )其他試驗(yàn) 1. 血壓及微循環(huán) 因?yàn)殛柮撟C (亡陽 )和陰脫證 (亡陰 )，均血壓和微循環(huán)異常，必須進(jìn)行血壓從微循環(huán)的觀察。 (2)治療心氣十足的藥物：可增加心功能衰竭模型、心功能測定及血流動(dòng)力學(xué)等有關(guān)試驗(yàn)。 (三 )陽性對(duì)照藥 陽脫證治療以回陽救逆固脫為上，可用參附湯、四逆湯、參附注射液、參附青注射液等作對(duì)照；陰脫證治療以益氣養(yǎng)陰固脫為主，如生脈散、參麥散、生脈注射液、茶麥注射液等作對(duì)照。如血壓下降，抬高儲(chǔ)血瓶回輸出血液，待儲(chǔ)血瓶內(nèi)最大放血量的 40％的血液自動(dòng)回輸機(jī)體時(shí)作為失代償朋，總放血量為 20— 30ml／ kg，此時(shí)再將全部放出的血液輸回機(jī)體，同時(shí)靜脈注射試驗(yàn)給藥，對(duì)照組以等量生理鹽水靜脈滴人。 4 注意點(diǎn) (1)放血速度不宜過快，否則會(huì)突然死亡。麻醉犬靜脈注射大腸內(nèi)毒素，觀察中毒性休克血流動(dòng)學(xué)的變化和抗休克作用，亦可進(jìn)行血液生化及酶學(xué)指標(biāo)觀察。細(xì)菌內(nèi)毒素種類很多，常用的大腸桿菌、鼠傷寒桿菌、各種痢疾桿菌、馬流產(chǎn)桿菌等制配方法、純度及動(dòng)物敏感性不同，其毒力不同，如鼠傷寒桿菌內(nèi)毒素對(duì)小鼠的 LD50為 3mg／ kg左右，而黏質(zhì)沙雷桿菌者達(dá) 35mg／ kg。 (3)靜脈注射內(nèi)毒素所致小鼠死多發(fā)生于 24h內(nèi)，宜在 24h內(nèi)記錄小鼠死亡時(shí)間。正中開胸，剪開心包，冠狀動(dòng)脈前降支末梢、根部下分別用小圓針穿入細(xì)絲線。用體溫儀測下體溫。從第一次結(jié)扎到 MAP降至休克水平的平均時(shí)間為 76． 4min，休克動(dòng)物 ECG均發(fā)生缺血性改變，MAP、 LVSP均顯著下降， BT降低， CVP、 LVEDP 上升但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (3)冠狀插管不可插入太深，方向應(yīng)與心臟房室曲線吻合。 2．操作方法 取健康家兔，腹腔注入烏拉坦麻醉，頸總動(dòng)脈插管經(jīng)生理記錄儀監(jiān)測血壓，左股動(dòng)脈插管以備取血樣。創(chuàng)傷組動(dòng)物肺濕／干重量比明顯高于對(duì)照組，肺泡表面活性物質(zhì)顯著減少，創(chuàng)傷組動(dòng)物胃黏膜見點(diǎn)狀、條索狀和片狀缺損，并有血現(xiàn)象。自由基不僅導(dǎo)致腸組織的脂質(zhì)過氧化損傷，也可造成腸外生命器官如心、肺、肝等組織的脂質(zhì)過氧化損傷，自由基參與此休克時(shí)的細(xì)胞損傷過程。腹部正中切于，生理鹽水紗布保護(hù)下分離出腸系膜上動(dòng)脈，以上創(chuàng)傷動(dòng)脈夾夾閉，關(guān)閉腹腔，動(dòng)物全身肝素化 (80ul／ 100g(體重 )]，關(guān)閉動(dòng)脈 1h后松夾。以 Folim— 酚試劑法作蛋白定量。全血及心、肝、腎組織活力降低。②作勻漿前心、肝、腎組織盡量剪碎，勻漿時(shí)每次時(shí)間和頻率要保持一致。正常情況下，心搏的激動(dòng)起源于竇房結(jié)，節(jié)律基本規(guī)則，頻率有 — 定范圍，沿竇房結(jié) —— 左右心房 —— 心室的傳導(dǎo)途徑，以一定的速度傳播到左右心室。 中醫(yī)學(xué)中類似心律失常癥狀的描述散見于心悸、怔忡、眩暈、昏厥等病癥中，病位以心為主，與肝、脾、腎、胃等關(guān)系密切，表現(xiàn)為虛 (氣、血、臟腑 )、實(shí) (瘀、滯、痰飲 )兩類，虛多見于氣血不足，陰陽失調(diào)和血脈瘀阻等原因引起。 Ⅲ 類為復(fù)極化抑制劑，如胺碘酮、 Stolol等。 二、藥效學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) (一 )對(duì)心律失常模型的防治作用 1．常用的動(dòng)物模型 主要兩類模型。包括：①冠狀動(dòng)脈結(jié)扎形成缺血性心律失常；②冠狀兩期結(jié)扎形成心律失常。③烏頭堿誘發(fā)的心律失常。⑤氯化鋇誘發(fā)的心律失常。⑦乙酰膽堿誘發(fā)的心律失常。 (3)煙堿誘發(fā)的心動(dòng)過緩模型：煙堿先興奮后抑制血管運(yùn)動(dòng)中樞、交感神經(jīng)節(jié)、腎上腺髓質(zhì)及頸動(dòng)脈化學(xué)感受，表現(xiàn)心率減慢、血壓下降、竇性停搏等。 3．方法學(xué)評(píng)價(jià) (1)動(dòng)物：小動(dòng)物 (大鼠、豚鼠、家兔、貓 )的心室纖顫有自發(fā)恢復(fù)的可能，因?yàn)闆_動(dòng)在比較短的通路中，可能在仍處不應(yīng)期的區(qū)域內(nèi)消失，異常興奮波將不可能形成環(huán)形運(yùn)動(dòng)。離體心臟標(biāo)本也可形成心律失常?？疾熘委熥饔每蛇x擇能維持心律失常較長叫間的動(dòng)物模型，心律失常發(fā)展的相對(duì)穩(wěn)定階段紿受試藥物，觀察指標(biāo)，判斷療效。 2 離體家兔竇房結(jié)起搏細(xì)胞動(dòng)作電位 將制好的家免竇房結(jié)標(biāo)本固定在充以 95％ O2+5％ CO2的 RL液灌流槽中．穩(wěn)定 12h，對(duì)竇房結(jié)進(jìn)行微電極探查，找出竇房結(jié)起搏細(xì)胞，并使動(dòng)作電位穩(wěn)定，然后分別紀(jì)錄細(xì)胞在給與待測藥物前、后和洗后的動(dòng)作電位變化，比較： MPR、 APD、 SRVPSEF和 APA。 三、動(dòng)物模型建立方法 (一 )電刺激臟誘發(fā)心律失常 1．原理 適度電刺激完全是可逆的，不損傷心肌，比其他方法更接近自然的異位沖動(dòng)，可因刺激電極度所按位置不同誘發(fā)房性和室性心律失常，隨刺激強(qiáng)度不同可引起早搏。還可以電壓為室顫的指標(biāo)，每 3min重復(fù)刺激，以兩次的平均電壓為對(duì)照值。復(fù)灌心律失常的發(fā)生機(jī)制可能為多個(gè)因素共同作用的結(jié)果，主要與心肌細(xì)胞電生理改變，腎上腺受體增加多，自由基損傷，鈣超負(fù)荷及鈣反?，F(xiàn)象有關(guān)。將節(jié)后抗膽堿藥與受體阻斷劑適當(dāng)配伍，則抗氯仿性心室纖顫的作用顯著增強(qiáng)。待呼吸剛剛停止后，立即將小鼠取出，紀(jì)錄心電圖或削胸檢查心室纖顫陽性率。觀察心律失常持續(xù)時(shí)間。 2．方法 豚鼠雌雄各半分組，皮下注射烏拉坦 1． 2g／ kg麻醉后，將豚鼠背位固定手術(shù)臺(tái)上，記正常 Ⅱ 導(dǎo) ECG，接心電示波器，隨時(shí)監(jiān)測心電變化?？剐穆墒СＫ幠苎泳徯穆墒С５陌l(fā)生或縮短心律失常持續(xù)時(shí)間