【正文】 慢性冠狀動脈閉塞、心肌缺血或觀察冠狀動脈側支循環(huán)的變化，用具有吸水性的塑料環(huán) (Ameroid環(huán) )套在冠狀動脈左旋支根部。實驗時注入蒸餾水，使氣囊膨脹，壓迫冠狀動脈造成心肌缺血，測量心外膜電圖或其他觀察指標 ,本法可反復阻斷冠狀動脈，進行多次清醒動物的心肌缺血實驗及再灌注損傷實驗。或用一個電極沿心表山一定途徑移，記出一個連續(xù)的心外膜電曲線。 (2)缺血區(qū)及梗死區(qū)面積的測定：在阻斷冠狀動脈血流孔后，經(jīng)左心耳根部向心房注人碳索墨水 1． 5ml／ kg， 2030s注完，迅速取下心臟，冰凍 30— 40min，在冠狀動脈結扎線下．平行冠狀溝等厚度將心室部分橫切成 5片，分別稱重，再用求積儀或電腦圖分析儀測量每片心肌兩面的墨水染色區(qū)與末染區(qū) (缺血區(qū) )，計算心肌缺血范圍的重量及百分比。 同時可測定血 ATP、 cAMP／ cGMP、無機離子、代謝物、能量代謝物質(zhì)等，如需了解藥物作用與前列腺素的關系，可觀察 PGl2或代謝產(chǎn)物的變化，以觀察藥物對的影響。 (2)正式實驗之前應熟練掌握動物開胸手術和冠狀動脈分離手術，盡量減少出血，做心包床時，心肌不應移位而影響心臟的正常舒縮功能。否則將影響實驗的準確性。 (二 )大鼠實驗性心肌梗死模型 I，原理 結扎大鼠的冠狀動脈前降支，阻斷其分布區(qū)域的心肌供血，心肌細胞長時間缺血缺氧而造成不可逆損傷和壞死。 (2)測定血漿生化指標：如 IDH、 CPK、 ATP、 cAMP／ cGMP、 PGI2／TXA2等。手術者必須熟悉冠狀動脈的分布和解削位置，便于定位。在藥效學研究可根據(jù)所試藥物的藥理作用及作用特點，選用不同的動物和模型。 (2)離體心臟缺血再灌注損傷模型：實驗一般用成年 Wistar種雄性大鼠，猛擊動物頭部使昏迷，快速開胸，摘取心臟、立即放人 4℃ 改良 KrebsHensleit液中，主動脈插管，裝于 Leaigendorff罐流裝置，以K— H液 (pH7． 4)恒溫 37℃ 進行灌流。③復灌期，剪斷結扎線，進行再灌注 15min。心肌梗死面積測定，實驗結束時，將心臟橫切染色，計算心肌梗死面積。在攪拌器上 37℃ 水浴消化 10min．自然沉淀后，丟上消液，沉淀的組織塊再加入胰蛋白酶，消化 l0min，然后吹打 1min，自然沉淀，上清移人離心骨中。 體外培養(yǎng)心肌細胞缺氧缺糖性損傷模型的建立方法：取培養(yǎng) 3日的心肌細胞，按下法進行缺氧缺糖實驗．①缺糖：實驗時采用無糖液或不含糖的 Eagle培養(yǎng)基代替正常培養(yǎng)。 3．測定指標 (1)形態(tài)學觀察：用臺盼蘭染色進行死活細胞鑒定，觀察細胞活力的改變及死亡比例，光學顯微鏡下可觀測心肌細胞形態(tài)變化，如偽足變化、胞泡形成、胞漿顆粒增加、異形 (長形、紡錘形 )心肌細胞的出現(xiàn)。 (4)其他：測定細胞內(nèi)氧化物歧化酶的變化從鈣離子運轉等。③適用于從細胞或分子水平進行機制研究。 (五 )藥物誘發(fā)心肌缺血模型 近年研究認為冠狀動脈痙攣是導致心肌急性缺血的主要原因之 — ．致心絞痛、心肌梗死和猝死。實驗前有心電圖或心律失常異常變化，則棄去不用，根據(jù)所試藥物特點選擇適當給藥途徑和間隔，靜脈給后 1— 5min腹腔注射后 15— 30min，灌胃后 12h，經(jīng)下靜脈或尾靜脈注射垂體后葉素 0． 5或 0． 7u／ kg，注射速度 5s或 l0s。 判定標準，以出現(xiàn)第一期或第二期缺血變化為陽性，否則為陰性，比較各組的差異，并做統(tǒng)計學處理。適用調(diào)節(jié)心肌代謝、氧供需平衡及作用于受體藥物的研究； (2)方法：健康大鼠、小鼠、豚鼠、家兔、貓或犬均可。心肌病理觀察可見：白細胞和巨噬細胞浸潤，心肌纖維腫脹、斷裂、橫 紋消失、甚至溶解，發(fā)生玻璃樣變和脂肪變性等。這種動物模型 可用以評價通過緩解冠狀動脈痙攣、攻善血液流變性等多種途徑．防治心肌缺血的藥物。生化指標： CPK、血小板聚集、 TXB kelo— PGF等變化。為簡化實驗方法，可試用貓、兔、大鼠或豚鼠 按照垂體后葉素實驗方法進行。 2．方法 健康犬或小型堵，雌雄兼用，體重 1215kg實驗動物用戊巴比妥鈉 (30mg／ kg) 靜脈麻酐，手術臺固定，分離氣管并插管，連接電動呼吸機，調(diào)節(jié)潮氣量300— 600ml，動脈氧 分壓維持在如 — 100mmHg，血 ph在正常范圍；左側第四肋開胸，露心臟，剪開心包，做 心包床：分離冠狀動脈左旋及主動脈根部。股動脈插管測定動脈血壓，以肢體導聯(lián)觀測標準導心電圖并計算心率。、實驗人員要經(jīng)過嚴格訓練，盡量減少對心肌功能的影響。研究中，應以多種指標綜合分析，了解平衡兩方面的變化，特別是凈效應，才能獲得準確的結論。實驗動物開胸完成后，分離冠狀動脈左旋支，放置適宜電磁流量探頭，測量冠脈血流量．測定動脈血壓。在冠脈左前降支下 1／ 3處，分離并結扎冠狀動脈，于遠端插入冠脈插管。分離股動脈，插入動脈管，記錄動脈血壓。 (2)冠狀靜脈竇血流量測定：通過測量冠狀靜脈竇血流量，反映冠脈血流量的變化，約 60％的冠脈血經(jīng)冠脈竇流入右心房。為尋找治療冠心病藥物，觀測心肌營養(yǎng)性血流量及冠脈總血流兩者配合更有意義。然后將心臟置玻璃研缽內(nèi)．磨成勻漿，放特制鋁箔小皿內(nèi)，在普通燈下烘干，用射線自動標器計數(shù)。③每只動物取心臟時所用剪刀、鑷子齊用 — 套．以防不同動物間相干擾。用多導Y能諾分析儀記心肌與參考血樣品的放射。 (5)離體心臟冠脈灌流法：哺乳動物離體心臟，插管人動脈灌流肘，灌流液須經(jīng)冠狀動脈經(jīng)右心房流出心臟，故流出量可代表冠脈流量，在灌注壓不變的條件下，其流量可反映冠脈阻力的變化。灌注約 15rain后，連續(xù)測定每分鐘冠脈流量 3次：待恒定后開始給藥，／ H量筒收集流出記錄給藥前后及給藥后每 lmin流出量。灌流液必須用新鮮蒸餾水臨時配制。用 6V直流電產(chǎn)生的斷續(xù)感應電震直接刺激心臟，或用方形波刺激器刺激，也用交流電刺激引起心纖顫，然后測定每 lmin冠脈流量的變化。心肌氧代謝的研究方法約分為三類。心肌缺血時內(nèi)膜下血流及氧張力下降甚于心外股，缺血什損傷及壞死也較外層心肌嚴重，因此，用雙暴露電極測定左心室外／內(nèi)膜下氧張力變化以研究藥物的影響，更有意義?；驕y氧儀直接測定心肌片的耗氧量。 ③正性肌力作用 ，心肌收縮力、心肌縮短速度與心肌耗氧呈線形關系，凡有正性肌力作用或延長射血時間者，均增加心肌耗氧量，可根據(jù)藥物指標的影響推測心肌耗氧量的變化。實驗方法較前者復雜，但可獲得較多信息，對藥物研究有 — 定實用價值。用小鼠或大鼠測定速度、存活時間及死亡時余存氧含量，可以較準確的反映出整體動物的耗氧速度及藥物的影響，較前者精細，但亦不能直接說明心肌的耐氧能力，耗氧速度。測定動脈血，冠狀靜脈或缺血區(qū)血液乳酸或鉀的含量，較心電圖及血流動力學更敏感的反映心肌缺氧程度及藥物的影響?？膳c實驗中同時測定的其他血流動力學指標如冠脈血流量、血壓、心電圖等連續(xù)描記于生理記錄儀，進行比較研究。取血量要適度，避免抽取血量過多而造成缺血。再經(jīng) — 定時間后處死動物，取心肌梗死區(qū)及對照區(qū)心肌組織，于冰浴上切、稱重，加入心肌孵液，于 37℃ 恒溫水浴平衡，然后將孵育液注入測氧儀，測氧分壓，孵育前后的氧分壓差值即為該組織的耗氧值。然后每瓶放人一只小鼠，各組動物分別給生理鹽水或藥物?；蛴醚b有氧電極的橡皮塞塞緊瓶，使氧電極與瓶內(nèi)氣體接觸，連接測氧儀，可測出瓶內(nèi)氧量變化，反映耗氧速度。厥證是指邪熱內(nèi)陷或陰寒內(nèi)盛所致的四肢逆冷病證。厥脫各證互相轉化，熱厥證外感溫熱病，熱毒內(nèi)陷．高熱致厥，進一步發(fā)展，熱毒熾盛、內(nèi)攻臟腑、陰液大耗而致陰脫證，也可熱傷氣陰，陰陽離決，陽氣暴脫而致陽脫證。引起的原因多種．如久血性、感染性、心源性、創(chuàng)傷性，過敏嚴重性休克等。 (2)感染性休克模型：用活菌、內(nèi)毒素或膿毒病灶復制感染性休克模型，可選用小鼠、大鼠，兔、貓，犬等。常用動物有小鼠、兔、貓等?？蛇x大鼠、免等。 3．方法學評價 上述各種方法造成的模型，可根據(jù)新藥的主治和功效選。 (二 )其他試驗 1. 血壓及微循環(huán) 因為陽脫證 (亡陽 )和陰脫證 (亡陰 )，均血壓和微循環(huán)異常，必須進行血壓從微循環(huán)的觀察。 (2)治療心氣十足的藥物：可增加心功能衰竭模型、心功能測定及血流動力學等有關試驗。 (三 )陽性對照藥 陽脫證治療以回陽救逆固脫為上，可用參附湯、四逆湯、參附注射液、參附青注射液等作對照；陰脫證治療以益氣養(yǎng)陰固脫為主，如生脈散、參麥散、生脈注射液、茶麥注射液等作對照。如血壓下降，抬高儲血瓶回輸出血液，待儲血瓶內(nèi)最大放血量的 40％的血液自動回輸機體時作為失代償朋，總放血量為 20— 30ml／ kg，此時再將全部放出的血液輸回機體，同時靜脈注射試驗給藥，對照組以等量生理鹽水靜脈滴人。 4 注意點 (1)放血速度不宜過快，否則會突然死亡。麻醉犬靜脈注射大腸內(nèi)毒素，觀察中毒性休克血流動學的變化和抗休克作用，亦可進行血液生化及酶學指標觀察。細菌內(nèi)毒素種類很多，常用的大腸桿菌、鼠傷寒桿菌、各種痢疾桿菌、馬流產(chǎn)桿菌等制配方法、純度及動物敏感性不同，其毒力不同，如鼠傷寒桿菌內(nèi)毒素對小鼠的 LD50為 3mg／ kg左右，而黏質(zhì)沙雷桿菌者達 35mg／ kg。 (3)靜脈注射內(nèi)毒素所致小鼠死多發(fā)生于 24h內(nèi)，宜在 24h內(nèi)記錄小鼠死亡時間。正中開胸，剪開心包，冠狀動脈前降支末梢、根部下分別用小圓針穿入細絲線。用體溫儀測下體溫。從第一次結扎到 MAP降至休克水平的平均時間為 76． 4min，休克動物 ECG均發(fā)生缺血性改變，MAP、 LVSP均顯著下降， BT降低， CVP、 LVEDP 上升但無明顯統(tǒng)計學意義。 (3)冠狀插管不可插入太深，方向應與心臟房室曲線吻合。 2．操作方法 取健康家兔，腹腔注入烏拉坦麻醉，頸總動脈插管經(jīng)生理記錄儀監(jiān)測血壓，左股動脈插管以備取血樣。創(chuàng)傷組動物肺濕／干重量比明顯高于對照組，肺泡表面活性物質(zhì)顯著減少，創(chuàng)傷組動物胃黏膜見點狀、條索狀和片狀缺損，并有血現(xiàn)象。自由基不僅導致腸組織的脂質(zhì)過氧化損傷，也可造成腸外生命器官如心、肺、肝等組織的脂質(zhì)過氧化損傷，自由基參與此休克時的細胞損傷過程。腹部正中切于，生理鹽水紗布保護下分離出腸系膜上動脈，以上創(chuàng)傷動脈夾夾閉，關閉腹腔，動物全身肝素化 (80ul／ 100g(體重 )]，關閉動脈 1h后松夾。以 Folim— 酚試劑法作蛋白定量。全血及心、肝、腎組織活力降低。②作勻漿前心、肝、腎組織盡量剪碎，勻漿時每次時間和頻率要保持一致。正常情況下，心搏的激動起源于竇房結，節(jié)律基本規(guī)則，頻率有 — 定范圍，沿竇房結 —— 左右心房 —— 心室的傳導途徑，以一定的速度傳播到左右心室。 中醫(yī)學中類似心律失常癥狀的描述散見于心悸、怔忡、眩暈、昏厥等病癥中，病位以心為主，與肝、脾、腎、胃等關系密切，表現(xiàn)為虛 (氣、血、臟腑 )、實 (瘀、滯、痰飲 )兩類，虛多見于氣血不足，陰陽失調(diào)和血脈瘀阻等原因引起。 Ⅲ 類為復極化抑制劑，如胺碘酮、 Stolol等。 二、藥效學研究的實驗設計 (一 )對心律失常模型的防治作用 1．常用的動物模型 主要兩類模型。包括：①冠狀動脈結扎形成缺血性心律失常；②冠狀兩期結扎形成心律失常。③烏頭堿誘發(fā)的心律失常。⑤氯化鋇誘發(fā)的心律失常。⑦乙酰膽堿誘發(fā)的心律失常。 (3)煙堿誘發(fā)的心動過緩模型：煙堿先興奮后抑制血管運動中樞、交感神經(jīng)節(jié)、腎上腺髓質(zhì)及頸動脈化學感受，表現(xiàn)心率減慢、血壓下降、竇性停搏等。 3．方法學評價 (1)動物：小動物 (大鼠、豚鼠、家兔、貓 )的心室纖顫有自發(fā)恢復的可能，因為沖動在比較短的通路中，可能在仍處不應期的區(qū)域內(nèi)消失，異常興奮波將不可能形成環(huán)形運動。離體心臟標本也可形成心律失常。考察治療作用可選擇能維持心律失常較長叫間的動物模型，心律失常發(fā)展的相對穩(wěn)定階段紿受試藥物，觀察指標，判斷療效。 2 離體家兔竇房結起搏細胞動作電位 將制好的家免竇房結標本固定在充以 95％ O2+5％ CO2的 RL液灌流槽中．穩(wěn)定 12h，對竇房結進行微電極探查，找出竇房結起搏細胞，并使動作電位穩(wěn)定，然后分別紀錄細胞在給與待測藥物前、后和洗后的動作電位變化，比較： MPR、 APD、 SRVPSEF和 APA。 三、動物模型建立方法 (一 )電刺激臟誘發(fā)心律失常 1．原理 適度電刺激完全是可逆的，不損傷心肌，比其他方法更接近自然的異位沖動，可因刺激電極度所按位置不同誘發(fā)房性和室性心律失常，隨刺激強度不同可引起早搏。還可以電壓為室顫的指標，每 3min重復刺激，以兩次的平均電壓為對照值。復灌心律失常的發(fā)生機制可能為多個因素共同作用的結果，主要與心肌細胞電生理改變，腎上腺受體增加多，自由基損傷，鈣超負荷及鈣反常現(xiàn)象有關。將節(jié)后抗膽堿藥與受體阻斷劑適當配伍，則抗氯仿性心室纖顫的作用顯著增強。待呼吸剛剛停止后，立即將小鼠取出，紀錄心電圖或削胸檢查心室纖顫陽性率。觀察心律失常持續(xù)時間。 2．方法 豚鼠雌雄各半分組，皮下注射烏拉坦 1． 2g／ kg麻醉后，將豚鼠背位固定手術臺上，記正常 Ⅱ 導 ECG，接心電示波器，隨時監(jiān)測心電變化?？剐穆墒СＫ幠苎泳徯穆墒С５陌l(fā)生或縮短心律失常持續(xù)時間