《酯酶與氧化酶》ppt課件-預(yù)覽頁(yè)
【正文】 脂肪酶水解甘油三酯為甘油二酯和脂肪酸 乙酰酯酶水解乙酰酯為醇和乙酸 乙酰膽堿酯酶 水解 乙酰膽堿 為 膽堿 和 乙酸 膽堿酯酶 水解 酯酰膽堿 為 膽堿 和 羧酸 根據(jù)酶對(duì)底物、 pH、激活劑、抑制劑的反應(yīng)特點(diǎn)，可將酯酶分為 20余種，在生物化學(xué)上統(tǒng)稱(chēng)為酯酶，只有一部分可用組化的方法證明。 二、酯酶的分類(lèi) （一）非特異性酯酶 (nonspecific esterase)： 無(wú)底物特異性。 （一）顯示法 １、反應(yīng)原理 在酶作用下，從底物游離出來(lái)的 ?萘酚 AS與 重氮鹽 偶聯(lián)形成 偶氮色素 ，同時(shí)沉著于酶的存在部位，通過(guò)偶氮色素顯色，間接證明酶的存在部位。 4. 結(jié)果與評(píng)價(jià) 酶活性部位為 黑色 ，胞核為 綠色 。 10%福爾馬林鈣、 4%多聚甲醛－磷酸緩沖液或二甲胂酸鹽緩沖液， 。） 3. 操作步驟 (1)恒冷箱切片入孵液， 37℃15 60min； (2)蒸餾水洗； (3)4%甲醛固定數(shù)小時(shí)； (4)甘油明膠封固。 ５ .注意 鐵氰化鉀氧化吲哚酚除產(chǎn)生靛藍(lán)外，還有無(wú)色產(chǎn)物。 弱陽(yáng)性：心肌細(xì)胞，胰島細(xì)胞，膽管、甲狀腺、氣管、支 氣管、膀胱等上皮細(xì)胞。 乙酰膽堿 +H2O 膽堿 +醋酸 酯酰膽堿 +H2O 膽堿 +羧酸 AChE ChE 四、乙酰膽堿酯酶和膽堿酯酶(Acetylcholinesterase and Cholinestrase, AChE and ChE) 乙酰膽堿酯酶 膽堿酯酶 乙酰膽堿 √（快） 高濃度時(shí)抑制其活性 √ 高濃度不抑制其活性 乙酰 β基甲基膽堿 √ － 苯甲酰膽堿 － √ （快） 長(zhǎng)鏈脂肪酸膽堿 － √ （快） AChE 和 ChE 的底物特異性 （一）顯示方法 —— 亞鐵氰化銅法 反應(yīng)原理 利用乙酰膽堿酯酶能將 乙酰膽堿鹽 水解產(chǎn)生硫代膽堿，使鐵氰化物還原為 亞鐵氰化物 ，再與銅離子結(jié)合形成 亞鐵氰化銅 顯色沉淀，證明酶活性的存在。 ４、結(jié)果與評(píng)價(jià) 乙酰膽堿酯酶和膽堿酯酶活性部位顯 棕色沉淀 。乙酰膽堿酯酶活性的強(qiáng)弱是 神經(jīng)細(xì)胞性質(zhì)和功能的重要參考指標(biāo) ，亦是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生過(guò)程中的 神經(jīng)細(xì)胞分化 的一個(gè)指標(biāo)，所以在形態(tài)上將乙酰膽堿酯酶的組織化學(xué)顯示作為 膽堿能傳遞部位的標(biāo)志。用其特異的抑制劑可以抑制其活性反應(yīng)。 五、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶 (choline acetyltransferase, ChAc) 此酶不屬于羧酸酯水解酶，它是 乙酰膽堿的合成酶 。 乙酰輔酶 A+膽堿 乙酰膽堿 +輔酶 A Pb2+ 沉淀產(chǎn)物 PbS↓ 硫化銨 ChAc 孵育液 25mmol/L N2羥基乙基哌嗪 N2乙烷磺酸緩沖 液 （ HEPES） 4mmol/L 膽堿 （ ） （ ） 18mmol/L 硝酸鉛 （ ） (乙酰膽堿酯酶抑 制劑 ） （ ） 最終 pH值為 。 （二）生物學(xué)意義 ChAc是 膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)志酶 ，是乙酰膽堿的合成酶，分布在 膽堿能神經(jīng)元和纖維內(nèi) ，其含量的多少，可說(shuō)明 神經(jīng)興奮性的高低 ，能充分反映神經(jīng)的功能。 激活劑： Ca2+、 Sr2+、 Mg2+、半胱氨酸、巰基乙酸、?；悄懰猁}。本法需 保持 Ca2+濃度 ，才有利于在Pb(NO3)2液內(nèi)進(jìn)行充分置換反應(yīng)。 脂酶的定位和組織分布： 脂酶主要存在于胞質(zhì)的基質(zhì)，高爾基復(fù)合體和線(xiàn)粒體也可出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。 MH2 → M + 2H (2H+ + 2e) (3) 加氧反應(yīng)： 向底物中直接加入氧原子或氧分子。 還原劑： 供電子體 Fe2+(亞鐵離子）。 常見(jiàn)的受氫體有： 輔酶 Ⅰ （ NAD+， nicotinamide adenine dinucleotide,尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸）； 輔酶 Ⅱ （ NADP+, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）； 黃素腺嘌呤二核苷酸 (FAD, Flavin adenine dinucleotide) 2. 電子傳遞鏈 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在線(xiàn)粒體內(nèi)經(jīng) 三羧酸循環(huán)、脂肪酸氧化等不同氧化分解途徑， 脫氫氧化 。 電子 只能從電子親和力 低 的傳遞體向親和力 高 的傳遞體傳遞。 細(xì)胞色素氧化酶使還原的細(xì)胞色素Ｃ再氧化，是線(xiàn)粒體的結(jié)構(gòu)成分之一。 （ 5）對(duì)照： 標(biāo)本孵育于含氰化鉀（ )的孵育液中，呈陰性反應(yīng)。 2）洗滌：冷固定液 15min， 3次； 3）恒冷箱切片； 4）孵育： 37 ℃ ， 4060min，充分洗滌； 5）復(fù)染； 6）封片。從反應(yīng)液中 去掉底物 DAB不能成為對(duì)照 ，因?yàn)?DAB同時(shí)也是成色劑。 骨骼肌 DAB法顯示 CCO 腎皮質(zhì) 腎髓質(zhì) （二）生物學(xué)意義 幾乎所有組織細(xì)胞都呈陽(yáng)性反應(yīng)，其 強(qiáng)度取決于細(xì)胞內(nèi)的線(xiàn)粒體數(shù)目 ，是 線(xiàn)粒體的標(biāo)志酶之一 。 反應(yīng)原理 以 DOPA(dihydroxyphenylalanine, 二羥苯基丙氨酸）為底物，氧化后經(jīng)一系列復(fù)雜反應(yīng)生成黑色產(chǎn)物。 (4) 換孵育液， 37℃12 15h。 5. 對(duì)照 去底物或用氰化物 6. 生物學(xué)意義 對(duì)診斷惡性黑素瘤有意義。利用它們的還原性或氧化性進(jìn)行組化染色。 (5)洗滌，脫水，甘油明膠封片。 五、輔酶非依賴(lài)性脫氫酶－琥珀酸脫氫酶 (Succinate dehydrogenase, SDH) 反應(yīng)原理 —— 四唑鹽法 琥珀酸被 SDH氧化為延胡索酸，脫氫通過(guò)中間受氫體吩嗪甲基硫酸酯（ PMS)，把四唑鹽 (NBT)還原為二甲簪。 6. 生物學(xué)意義 三羧酸循環(huán)標(biāo)志酶 ；心、肝、腎豐富； 定位線(xiàn)粒體 。 6. 生物學(xué)意義 凡能進(jìn)行糖酵解的細(xì)胞都有此酶存在，細(xì)胞損傷可有此酶釋
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