《單克隆抗體技術(shù)》ppt課件-預(yù)覽頁
【正文】 以保持雙方親代細(xì)胞的特性 ? 利用代謝缺陷補(bǔ)救機(jī)理篩選雜交瘤細(xì)胞，并克隆化，制備 McAb 可生 產(chǎn) 有用抗 體 的 淋巴細(xì)胞 若 與 癌 細(xì) 胞 融合， 則 形成 穩(wěn) 定而可培養(yǎng) 的 細(xì) 胞 株 。③使用細(xì)胞因子作為佐劑，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，促進(jìn)免疫細(xì)胞對抗原反應(yīng)性。 ? 融合比例： ? 骨髓瘤細(xì)胞：脾細(xì)胞 =1： 5或 1： 10 ? 融合劑： 40%PEG（分子量 10002022） ? 融合 24小時(shí)后加 HAT培養(yǎng)液 2周后 改用 HT培養(yǎng)液 2周后 改用一般培養(yǎng)液 d 細(xì) 胞融合 a b c d Ag X Ag X’ ELISA HAT PEG Cell fusion Hybridoma cells 融合瘤 細(xì) 胞 （ Subcloning） (確 定只有一 種細(xì) 胞 ) d’ d a b c d a b c d’ + + + + + + + X d c b a + d NS1 骨 髓 癌 細(xì) 胞 B cell 脾 細(xì) 胞 分株培 養(yǎng)篩選 篩選 單 抗 傳統(tǒng)抗體 (抗血清 ) 試驗(yàn)專 一性 對 抗 原 的 反 應(yīng) 無 法 分 辨 完 全 不 同 d 舊 有抗原 d’ 新的抗原 ? 一般在雜交瘤細(xì)胞布滿孔底 1/10時(shí)，開始檢測特異性抗體，篩選出所需雜交瘤細(xì)胞系。 ? 克隆化的原則：盡早進(jìn)行，反復(fù) 45次 ? 克隆化方法： 有限稀釋法 、軟瓊脂平板法、顯微克隆法 ? 陽性雜交瘤細(xì)胞應(yīng)及時(shí)凍存，防染色體丟失、變異及污染 ● 一 個(gè) B 細(xì) 胞只能生 產(chǎn) 一 種 抗體， 對 付某一 抗原決定基。 構(gòu)建嵌合抗體的大致過程是，將鼠源單抗的 可變區(qū)基因 克隆出來，連到包含有 人抗體恒定區(qū)基因及表達(dá)所需的其它元件 (如啟動子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記等 )的表達(dá)載體上，在哺乳動物細(xì)胞 (如骨髓瘤細(xì)胞、 CHO細(xì)胞 )中表達(dá)。 人一鼠嵌合抗體與鼠單抗相比， 免疫原性大大降低，利于在人體內(nèi)應(yīng)用 ，所以目前已制備出上百種抗各種抗原 (包括腫瘤相關(guān)抗原 )的嵌合抗體。 經(jīng)過 CDR移植， 抗體的免疫原性極低，而其抗原結(jié)合能力保持不變， 結(jié)合半抗原及全抗原 (如細(xì)胞表面受體、病毒等 )的改形抗體都已有報(bào)道，到現(xiàn)在已有數(shù)百種人源化抗體。 定點(diǎn)突變法 是將人的可變區(qū)基因克隆，根據(jù)鼠抗體的 CDR 序列合成幾種突變引物，用定點(diǎn)突變的方法將人的可變區(qū)基因的 CDR序列變?yōu)槭罂贵w的 CDR序列，然后表達(dá)出改型抗體。 分子小，穿透力強(qiáng) 。 3 小分子抗體 Fv ScFv 單區(qū)抗體 最小識別單位 Fab 由完整的 輕鏈和 Fd組成，大小為完整分子的 1/3。 在 VH與 VL之間加上一段連接肽，把 VH與 VL連成一條單鏈，得到 ScFv，即單鏈抗體 。 在具備親本單抗可變區(qū)的 cDNA克隆時(shí)，可用 定點(diǎn)突變法 在其兩端造成適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶位點(diǎn)，與人工合成的連接肽編碼序列連接，組裝到表達(dá)載體中 。 二是 分泌型表達(dá) ，將細(xì)菌的信號肽序列與單鏈抗體的氨基端相連，單鏈抗體分子就可分泌到質(zhì)周腔和細(xì)菌體外，進(jìn)行折疊后成為有活性的分子。 單域抗體盡管親和力有所降低，但仍保持著原單抗的特異性。 雙特異性抗體 (bispecific antibody,BSAb)是指能同時(shí)識別 2種抗原的抗體。 Hollinger等巧妙地將Ａ抗原抗體的輕鏈可變區(qū)基因 (VLA)與抗Ｂ抗原抗體的重鏈可變區(qū) (VHB)通過短肽連接子連接 。 抗體庫技術(shù)是用基因工程方法把人或其他動物的全部抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因 克隆出來，在原核載體上表達(dá)，然后篩選出所需的特異基因和抗體。 5 抗體庫技術(shù) 初期的抗體庫技術(shù)是從淋巴細(xì)胞中提取總 RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA或直接用總 DNA為模板，用 PCR技術(shù)建立輕、重鏈文庫，在大腸桿菌中表達(dá)后篩選。該技術(shù)的成功給抗體基因的篩選工作帶來了革命性的變革。 可繞過雜交瘤技術(shù)，不需要復(fù)雜的基因工程技術(shù) 。 適用范圍廣，既可用于抗體制備，也適用于其它蛋白如激素、酶、藥物、隨機(jī)多肽等
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