【正文】 BAC載體。 ?超聲波處理后的 DNA片段 呈平頭末端 ，需加裝人工接頭。 但由于 T4 DNA連接酶既能連接粘性末端還能連接平末端 ， 而 DNA連接酶主要連接粘性末端 ， 所以一般連接反應(yīng)中都用 T4 DNA連接酶 。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 28 （ 3）避免 外源 DNA片段之間的連接 措施 ? 在基因組 文庫的構(gòu)建過程中， 最應(yīng)引起重視的問題是：嚴(yán)禁外源 DNA片段之間的連接！?。? ? 為了避免上述情況的發(fā)生， 可采取下列措施的組合： ? 將待連接的 DNA片段根據(jù)載體的裝載量 分級分離 ? 用堿性磷酸單酯酶除去 DNA片段的末端磷酸基團(tuán) ? 用酶在 DNA片段的末端上增補(bǔ)同聚尾末端 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 29 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 30 重組 DNA導(dǎo)入宿主及篩選 ? 轉(zhuǎn)化 ? 轉(zhuǎn)導(dǎo) ? 轉(zhuǎn)染 ? 感染 ? 結(jié)合 ? 其它 2022/2/12 31 密集鋪板（ 110萬） ? 雜交 ? 挖取 目的重組克隆 ? 鋪板 ? 鋪板 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 32 構(gòu)建噬菌體基因組文庫的主要步驟 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 33 用粘粒載體建立基因組文庫的主要步驟 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 34 基因組文庫重組克隆的排序 ? 大型基因文庫（包括人的基因文庫）的構(gòu)建在技術(shù)上并不十分困難，如果一個 YAC基因文庫的插入片段總和為整個基因組的十倍以上時，一般就能從基因文庫中調(diào)出任何一段 DNA序列。 ? 用 20種探針隨機(jī)定位雜交（一對一） 20份 YAC克隆薄膜。構(gòu)建成的文庫僅是一個雜亂無章的“基因圖書館”，要想從中找到所需基因，必須有一些相關(guān)線索。但需制備探針，所用探針有多種，獲得探針的方法很多； （ 2）免疫學(xué)檢測方法 （ 3） DNA同胞選擇法（極少用） 使用抗體探針，通過檢測重組克隆表達(dá)出的蛋白質(zhì)來篩選目的克隆。 2022/2/12 47 大腸桿菌作為寄主進(jìn)行 DNA克隆的實驗方案 DNA片段 的獲得 載體構(gòu)建 細(xì)菌轉(zhuǎn)化 重組體 的鑒定 限制性內(nèi) 切酶消化 機(jī)械切割 雙鏈 cDNA 的合成 化學(xué)法 直接合成 同聚物 加尾 粘性末端 連接 平末端 連接 加接頭造成 粘性末端 重組噬菌體 DNA轉(zhuǎn)染 重組質(zhì)粒 的轉(zhuǎn)化 體外包裝 進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo) 表型鑒定 核酸雜交 免疫學(xué)分析 酶切鑒定 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 48 ? 圖克隆策略的一般總結(jié)，箭頭顯示了最佳路線。 . cDNA library mRNA cDNA 3’ 3’ 5’ 5’ 反轉(zhuǎn)錄酶 引物 利用某種生物的 總 mRNA合成 cDNA，再將這些 cDNA與載體連接，轉(zhuǎn)入細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行保存和擴(kuò)增，稱 cDNA文庫。 （ 4）比 DNA文庫小 的多，容易構(gòu)建。 mRNA只占總 RNA的 1%2%。 mRNA cDNA 3’ 3’ 5’ 5’ 反轉(zhuǎn)錄酶 引物 mRNA cDNA第一鏈 3’ 3’ 5’ 5’ 引物 cDNA第一鏈 3’ 5’ 引物 ② 降解 mRNA模板 或 RNaseH 堿 2022/2/12 57 剩下的 cDNA單鏈的 3’末端一般形成一個 彎回來的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu) （機(jī)理不明），可成為合成第二條 cDNA鏈的引物。 或借助 末端轉(zhuǎn)移酶 給載體和雙鏈 cDNA的 3’端分別加上幾個 C或 G，成為粘性末端。 ? ③ cDNA的甲基化 (非必需步驟 )。 ? ⑦重組 cDNA導(dǎo)人宿主菌。 2022/2/12 64 通過 PCR直接擴(kuò)增出目的基因策略 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 65 ? 優(yōu)缺點： 與傳統(tǒng)的 DNA克隆方法比較 ， 省時、省力 , 但要求待擴(kuò)增的 DNA片段的序列必需是已知的 ， 至少要求兩端長約 20bp的序列是已知的。即 在兩對引物中 ， 一對引物與靶序列的復(fù)性結(jié)合位點 處于 另一對引物擴(kuò)增的 DNA序列內(nèi) ， 前者稱為內(nèi)部引物 ，后者稱為外側(cè)引物。反向 PCR包括下列三個步驟 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 68 首先 ， 用限制性核酸內(nèi)切酶消化待測線性 DNA模板。 ? 常見的錨定 PCR類型是利用未知序列中一小段已知序列的信息來擴(kuò)增合成已知序列上游或下游片段 ， 最后獲得全部序列。與基因特異配對的引物通常是在未知序列中一小段已知序列的基礎(chǔ)上設(shè)計合成的 ，而該已知序列一般是由純化蛋白的部分氨基酸序列推測出來或從其他材料中獲得的部分 mRNA序列。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 72 第一 連續(xù) RTPCR( 兩階段單管式 ) ? 由 mRNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA和 DNA的 PCR擴(kuò)增是兩個完全不同的酶催化反應(yīng)過程 ， 連續(xù) RTPCR將這兩種不同的酶催化過程放在一個管中連續(xù)反應(yīng) ， 但在空間上兩種反應(yīng)仍是分開進(jìn)行。進(jìn)行 PCR循環(huán)時 ， 首先進(jìn)行 95℃熱起始 ， 再加入 Taq DNA聚合酶 ， 采用雙 shuttle PCR 程序延長合成時間 ， 由此擴(kuò)增出長達(dá) 4～ 6 kb的 DNA片段。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 75 鍋柄 PCR實施步驟 ? ①用內(nèi)切酶消化環(huán)狀 dsDNA產(chǎn)生 5‘黏 末端線型 DNA片段 ， 用 Klenow酶填平 5’黏 末端 ， 然后用 BAP脫去 539。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 76 ? ③將連接物變性后再冷卻復(fù)性 ， 其中一條單鏈DNA分子 (負(fù)鏈 )由于附 加引物而與互補(bǔ)區(qū)域以堿基配對形成鍋柄狀的鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu) ， 而正鏈的附加引物是不能互補(bǔ)的。 ? ⑥變性后再次冷卻生成鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu) ， 得到另一條鏈的模板 ， 龜縮的 3‘端同樣可作引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增而得到全長片段 ， 其中未知基因處于中間 ， 3‘、 539。 這個步驟可以依據(jù)待分離目的基因的有關(guān)特性 ,如基因的 序列、功能、在染色體上的位置和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 mRNA等 ,建立相應(yīng)的方法加以完成。 一種最簡單的方式是 ， 將大腸桿菌 DNA的克隆片段 “ 庫 ” 中的重組 DNA分子分別導(dǎo)入一種大腸桿菌營養(yǎng)缺陷型菌株的受體細(xì)胞 ， 然后將此受體細(xì)胞涂布在一種缺少該菌株所需要的營養(yǎng)底物的基本培養(yǎng)基上 結(jié)果只有那些獲得了營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因的受體細(xì)胞才會長成轉(zhuǎn)化子菌落。 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 86 ? 把濾膜放在平板上 ， 將噬菌斑中的噬菌體顆粒影印到濾膜上 ， 使噬菌體 DNA結(jié)合在濾膜上。 基本過程圖 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 87 表達(dá)序列標(biāo)簽法分離目的基因 ? ? 表達(dá)序列標(biāo)簽 (expressed sequence tag,EST)是指基因序列中一段 能特異地標(biāo)記或表征基因的序列 ， 通常它含有足夠的結(jié)構(gòu)信息以 顯示出 該 基因與其他基因的差 異 ，長度一般為 100～ 500bp。 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 88 基本步驟 ? 從組織特異性或細(xì)胞特異性的 cDNA文庫中隨機(jī)挑選克隆 ， 進(jìn)行 5‘ 端和 3’ 端部分序列 (約 400bp)的測定。 特別適用于分離在特定組織中或發(fā)育的特定階段表達(dá)的基因以及受生長因子調(diào)節(jié)的基因 ， 亦可有效地用來分離經(jīng)特殊處理誘導(dǎo)表達(dá)的基因。當(dāng)以目的基因表達(dá)的 mRNA群體為探針時 ， 所有包含重組體的菌落都呈陽性反應(yīng) ， 在 X線底片上呈現(xiàn)黑色斑點 ， 而以目的基因不表達(dá)的 mRNA群體為探針時 ， 除了含有目的基因的菌落外 ， 其余的所有菌落都呈陽性反應(yīng) ， 在 X線底片上呈現(xiàn)黑色斑點。在這些同位素標(biāo)記的探針中 ， 僅有極少的一部分能與目的基因核苷 酸序列完全互補(bǔ) ， 所以那些低豐度的 mRNA很難用此法檢測出來。 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 93 減法雜交技術(shù) ? 減法雜交 (subtractive hybridization)， 又叫做 差減雜交克隆、扣除雜交、減數(shù)雜交或消減雜交 等 ， 該技術(shù)是 通過 DNA復(fù)性動力學(xué)原理富集目的基因序列 ， 并以此構(gòu)建 減數(shù)文庫 的方式來進(jìn)行目的基因分離克隆的。 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 95 ? 以 mRNA減法雜交為例 ， 基本原理是 ， 從表達(dá)目的基因的組織中 提取 mRNA并反轉(zhuǎn)錄為 cDNA, 然后與無目的基因表達(dá)的組織中提取的 mRNA做過量雜交 ， 在兩種組織中均表達(dá)的基因產(chǎn)物形成 cDNA/mRNA雙鏈雜交分子 ， 而特異mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA片段仍保持單鏈狀態(tài) , 將這種單鏈cDNA分離出來即為 差異表達(dá)的序列 。同時從缺失突變生物體制備總DNA， 經(jīng)超聲波隨機(jī)切割之后 ，用生物素進(jìn)行標(biāo)記供作 驅(qū)使DNA探針 。 ? E 最后用 Southern雜交法進(jìn)一步鑒定 ， 如果該片段 B同野生型 DNA雜交而不能與突變型生物體 DNA雜交 ， 則證明該片段確實為缺失片段?？梢栽O(shè)計總共 12種不同的下游引物 ， 合成第一鏈 cDNA。這個數(shù)字大體上涵蓋了在一定的發(fā)育階段某種類型細(xì)胞中所表達(dá)的全部的 mRNA種類。2022/2/12 101 ? 在 PCR反應(yīng)中加入放射性核素 35S或 32p標(biāo)記反應(yīng)產(chǎn)物。 篩選文庫，找到差別基因的全長序列。 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 106 ①檢測 DNA和驅(qū)趕 DNA的制備 ? 正常 與 突變基因組 DNA經(jīng)能限制性核酸內(nèi)切酶作用后 ，再連上含有該酶酶切位點的寡核 苷 酸接頭 R24～ R12，以R24為引物 PCR擴(kuò)增后 ， 正常 組 用同一內(nèi)切酶切下接頭再連上另一組含有該酶酶切位點的接頭 J24～ J12并 以 J24為引物 PCR擴(kuò)增制成 檢測 DNA（ TDNA)； 突變基因組不再連上另一組接頭制成 驅(qū)趕 DNA(DDNA)。T/D ? 驅(qū)趕 DNA自身復(fù)性 。 以此 PCR產(chǎn)物作為檢測 DNA再次與過量的驅(qū)除 DNA雜交 ， 重復(fù)三輪雜交后即能充分富集出驅(qū)趕DNA中缺失的片段 ， 富集倍數(shù)可達(dá) 106倍 。因此 SSH顯著增加了獲得低豐度表達(dá)差異 cDNA的概率 ， 簡化了對消減文庫的分析。長鏈 3‘端與 cDNA5’端相連。 ? 第一次雜交的目的是 實現(xiàn)檢測單鏈 cDNA的均等化 ， 也就是使原來有豐度差別的單鏈 cDNA的相對含量達(dá)到基本一致。 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 115 ? ⑤第一次 PCR反應(yīng)。 ? ⑦差異片段的初步篩選。 2022/2/12 117 思考題 ? 1名詞解釋：目的基因 基因庫與基因文庫 表達(dá)序列標(biāo)簽 差別雜交法 減法雜交 ? 2 代表性差別分析技術(shù) 流程