【正文】 性，并顯著縮短SeC對MCF7起作用的時間。 實(shí)驗(yàn)儀器表22 實(shí)驗(yàn)儀器Table 22 Apparatus used in experiment儀器名稱型號產(chǎn)地電子天平BP301S德國Sartorius 公司離心機(jī)Centrifuge 5804REppendorf超聲破碎儀JY92IIDN寧波新芝生物科技股份有限公司納米粒度儀NanoZS英國馬爾文(Malvern)公司透射電子顯微鏡TECNAI10荷蘭Philips相關(guān)儀器原理（1）NanoZS型納米粒度儀英國馬爾文公司(Malvern) NanoZS型納米粒度儀，入射光為氦氖激光，波長λ = 633 nm，入射角90176。其依據(jù)的光學(xué)原理為Fraunhofer衍射和Mie散射理論，因此相應(yīng)的激光粒度分析儀分為激光衍射式和激光動態(tài)散射式兩類。本論文中，利用納米粒度儀來快速、準(zhǔn)確方便地對納米溶膠樣品中顆粒的大小及分布、形態(tài)等進(jìn)行測定。 實(shí)驗(yàn)方法稱取CS溶于2%乙酸溶液中，攪拌使其溶解后備用。(1)不同油相體系的選擇（1）（2）（3）（4）（5）的方法是平行的，用最佳條件做就好了~水相：稱取分子量為60000的殼聚糖（90%）的殼聚糖500 mg，溶于25 mL 2% 醋酸溶液中配制成20 mg/mL的殼聚糖溶液，攪拌至完全溶解備用。(2)不同油水比的選擇水相：稱取分子量為60000的殼聚糖（90%）的殼聚糖500 mg，溶于25 mL 2% 醋酸溶液中配制成20 mg/ml的殼聚糖溶液，攪拌至完全溶解備用。(3)不同表面活性劑用量的選擇水相：稱取分子量為60000的殼聚糖（90%）的殼聚糖500 mg，溶于25 mL 2% 醋酸溶液中配制成20 mg/mL的殼聚糖溶液，攪拌至完全溶解備用。(4)不同殼聚糖濃度的選擇水相：分別稱取分子量為60000的殼聚糖（90%）的殼聚糖250 mg, 375 mg, 500 mg, 625 mg溶于25 mL 2% 醋酸溶液中配制成濃度分別為10 mg/mL，15 mg/mL，20 mg/mL，25 mg/mL的殼聚糖溶液，攪拌至完全溶解備用。(5)不同交聯(lián)劑用量的選擇水相：稱取分子量為60000的殼聚糖（90%）的殼聚糖375 mg溶于25 mL 2% 醋酸溶液中配制成濃度為15 mg/mL的殼聚糖溶液，攪拌至完全溶解備用。取500 μL CS溶液緩慢滴加到油相溶液中，經(jīng)超聲2 h處理后形成穩(wěn)定的W/O型微乳液，%，1%，3%，5%，7%的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌3 h，8000 r/min離心，然后用無水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。 sizesNo.size()PdIparaffintolueneparaffintoluene1 2 3 4 油相體系對納米粒子粒徑的影響Fig. Comparison of different oil phase on nanoparticles’ size 油水比對殼聚糖納米粒子的影響(1)粒徑分布及其穩(wěn)定性的分析。表24 油水比對納米粒子粒徑的影響Table 24Effect of the ratio of paraffin to CS on nanoparticles 39。結(jié)果與納米粒度儀測得的平均粒徑大約相符。隨著油相體積增加，油包水乳液的油膜增厚，形成的乳滴較穩(wěn)定，且分散均勻，交聯(lián)固化后的產(chǎn)物呈圓球狀。在體系中加入乳化劑是為了獲得穩(wěn)定的乳液。結(jié)果表明，控制span80的用量為油相體積的3%可以取得粒徑較小的產(chǎn)物。 sizes(B1) 2% (B2) 3% (B3) 4% (B4) 5% (B5) 6%(2)TEM 分析TEM觀察形貌：將樣品分散均勻，用銅網(wǎng)蘸取樣品后用磷鎢酸進(jìn)行染色，以確定所得樣品微粒的大小、形貌和均勻性，并拍攝有代表性的電鏡照片。當(dāng)乳化劑用量適中，形成的乳滴分散均勻，交聯(lián)固化后形成的納米粒子粒徑較小，且分布均勻，TEM成像時襯度足夠，故磷鎢酸染色后，仍呈黑色圓球。由表24與圖28可見，當(dāng)殼聚糖溶液濃度為10 mg/ml時，產(chǎn)物的粒徑達(dá)到了微米級。這可能是由于殼聚糖濃度增加，粘度也隨著增加，殼聚糖間互相粘連使得乳化時分子較大，最終造成交聯(lián)得到的粒子粒徑也變大。 sizes(C1) 10 mg/mL (C2) 15 mg/mL (C3) 20 mg/mL (C4) 25 mg/mL(2) TEM 分析TEM觀察形貌：將樣品分散均勻，用銅網(wǎng)蘸取樣品后用磷鎢酸進(jìn)行染色，以確定所得樣品微粒的大小、形貌和均勻性，并拍攝有代表性的電鏡照片。殼聚糖濃度較大，納米粒子間粘連現(xiàn)象嚴(yán)重，造成產(chǎn)物粒徑大。這可能是由于選擇的交聯(lián)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)適中，在體積較小時已經(jīng)能夠與殼聚糖交聯(lián)固化，當(dāng)體積增加時，多余的交聯(lián)劑不參加交聯(lián)。 sizes②不同交聯(lián)劑濃度，殼聚糖納米粒子的粒徑與交聯(lián)劑的濃度有關(guān)。但濃度太大，導(dǎo)致局部濃度過大而使得局部液滴間也進(jìn)行交聯(lián)，造成粒徑分布不均勻，且粒徑增加。 sizes(E1) % (E2) 1% (E3) 3% (E4) 5% (E5) 7% (2)TEM 分析TEM觀察形貌：將樣品分散均勻，用銅網(wǎng)蘸取樣品，以確定所得樣品微粒的大小、形貌和均勻性，并拍攝有代表性的電鏡照片。但濃度太大，導(dǎo)致局部濃度過大而使得局部液滴間也進(jìn)行交聯(lián)，造成粒徑分布不均勻，且粒徑增加。通過各種表征方法分析各因素對殼聚糖納米粒子形成的粒徑與形貌的影響。 mg。①水相的配制殼聚糖溶液的配置：稱取分子量為60000的殼聚糖（90%）的殼聚糖375mg溶于25 ml 2% 醋酸溶液中配制成濃度為15 mg/ml的殼聚糖溶液，攪拌至完全溶解備用。取配制好的含SeC的殼聚糖溶液緩慢滴加到油相溶液中，經(jīng)超聲2h處理后形成穩(wěn)定的W/O型微乳液，然后逐漸滴加1 mL 3%的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌3 h，8000 r/min離心，然后用無水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液（CSNPs）。 TEM分析TEM結(jié)果與納米粒度儀測得的平均粒徑大約相符。這可能是由于殼聚糖納米粒子的總量一定，隨著投藥量的增加，進(jìn)入殼聚糖納米粒子中的藥物量也增加。因此，在制備載藥殼聚糖納米粒子時，要考慮投藥量對載藥率和包封率的影響。 實(shí)驗(yàn)儀器表22實(shí)驗(yàn)儀器Table22 Apparatus used in experiment儀器名稱型號產(chǎn)地電子天平BP301S德國Sartorius 公司離心機(jī)Centrifuge 5804REppendorf超聲破碎儀JY92IIDN寧波新芝生物科技股份有限公司電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀Optima2000DV美國PerkinElmer 公司納米粒度儀NanoZS英國馬爾文(Malvern)公司酶標(biāo)儀ELX800型美國BioTek公司透射電子顯微鏡TECNAI10荷蘭Philips 實(shí)驗(yàn)原理（1）細(xì)胞培養(yǎng)MCF7乳腺癌細(xì)胞購買于美國模式培養(yǎng)物保藏所 (ATCC)。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。L，置與37 ℃，5% CO2培養(yǎng)特定時間，然后加入MTT溶液（5 mg/mL）20 181。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。往培養(yǎng)板加入MTT (5 mg/mL) 20 μL/孔，37 ℃孵育5 h后吸棄培養(yǎng)板孔中的液體，加入DMSO 150 μL/孔，振蕩10 min，紫色結(jié)晶物充分溶解后，測定各孔OD570值。通過圖22A可以看出，殼聚糖納米粒子里包入了SeC，粒徑大約在400500 nm左右，與納米粒度儀得到的粒徑大約相符。 SeCCSNPs對MCF7細(xì)胞的生長抑制作用.細(xì)胞分別用SeCCSNPs和SeC處理24 小時.通過觀察殼聚糖負(fù)載SeC納米粒子在24 h,36 h,72 h對MCF7細(xì)胞作用的實(shí)時圖像，殼聚糖載藥納米粒子在低劑量時對MCF7細(xì)胞具有較明顯的抑制作用。第五章 總結(jié)與展望 總結(jié)本文使用乳化交聯(lián)法制備殼聚糖納米粒子，考察了影響其質(zhì)量的五種因素，并通過負(fù)載SeC研究投藥量對包載性能的影響。3. 通過SeCCS納米粒子對MCF7乳腺癌細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)中得知，殼聚糖納米粒子能夠增強(qiáng)MCF7對SeC的吸收，增強(qiáng)其對MCF7乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性?？傊瑢ぞ厶羌{米粒子作為藥物載體是具有廣闊的應(yīng)用前景的研究方向。感謝本課題組喻波,李英華,王弋,吳華蓮,李林林,劉雯,禹蓮玲等師兄師姐對我的幫助，特別感謝喻波師兄的指導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)過程和論文撰寫的過程中師兄都給予了我極大的幫助，使我的論文得以順利地完成。 Pharmacotherapy, 2009, 63(2): 105113.[16] Chen, T,. Wong. Selenocystine Induces SPhase Arrest and Apoptosis in Human Breast Adenocarcinoma MCF7 Cells by Modulating ERK and Akt Phosphorylation [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(22): 1057410581.[17] 韓新愛, 曾慧蘭. 納米技術(shù)在腫瘤診治中的應(yīng)用與發(fā)展[J]. 廣東醫(yī)學(xué), 2009, (01).[18] 桑士晶, 楊瑞. 納米技術(shù)前景展望[J]. 中國新技術(shù)新產(chǎn)品, 2012, (06).[19] 樊東黎. 納米技術(shù)和納米材料的發(fā)展和應(yīng)用 [J]. 金屬熱處理, 2011, (02).[20] 唐勝利. 納米技術(shù)與腫瘤治療 [J]. , 2003, (04).[21] 錢倩, 王伯瑤. 納米藥物載體在醫(yī)藥領(lǐng)域中的研究進(jìn)展 [J]. 濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2006, (02).[22] 張士新, 李芳秋. 納米藥物載體在腫瘤治療中的應(yīng)用 [J]. 中華腫瘤防治雜志, 2010, (13).[23] 胡興, 鄒國林. 生物可降解聚合物納米粒給藥載體 [J]. 氨基酸和生物資源, 2003, (02).[24] Duncan, R. and L. Izzo. Dendrimer biopatibility and toxicity [J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2005, 57(15): 22152237.[25] 陳孟婕. 基于生物大分子的納米藥物載體 [J]. 化學(xué)進(jìn)展, 2011, (01).[26] 于永鵬, 徐孝旭. 殼聚糖作為藥物緩釋載體的應(yīng)用及進(jìn)展 [J]. 材料導(dǎo)報, 2011, (S1).[27] Julkapli, ., . Akil, and Z. Ahmad. Preparation, Properties and Applications of ChitosanBased Bioposites/Blend Materials: A Review [J]. Composite Interfaces, 2011, 18(6): 449507.[28] Sinha, ., et al. Chitosan microspheres as a potential carrier for drugs [J]. nternational Journal of Pharmaceutics, 2004, 274(12): 133.[29] 王亞紅. 殼聚糖及其衍生物在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用 [J]. 天津化工, 2005, (05).[30] 曹晶, 孫淑愛, 盧鳳琦. 殼聚糖的生物學(xué)評價 [J]. 中國公共衛(wèi)生, 2005, (03).[32] Agnihotri, ., . Mallikarjuna, and . advances on chitosanbased micro and nanoparticles in drug delivery [J]. Journal of Controlled Release, 2004, 100(1): 528.[31] 楊婷, 侯文龍, 楊越冬. 殼聚糖微球的制備及其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用 [J]. 高分子通報, 2011, (05).[33] 張麗, 宋益民, 張學(xué)成. 殼聚糖載藥微球的制備及應(yīng)用研究進(jìn)展 [J]. 海洋科學(xué), 2009, (04).[34] 沈宏亮. 左氧氟沙星羧甲基殼聚糖緩釋微球的制備及其體外釋放研究 [J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2004, (05).[35] He, P., . Davis, and L. microspheres prepared by spray drying [J]. International Journal of Pharmaceutics, 1999, 187(1): 5365.[36] Shao, ., et chitosan microspheretemplated microcapsules suitable for spontaneous loading of heparin [J]. Materials Science