【正文】 with MB, the signal of MB m/z 285 is far away from the background signal of the tumor tissue. So it can reduce the background interference and improve the sensitivity of detection. The appropriate delay time of two lasers is optimized and is found to fall in the range of 1835181。在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)兩束光之間的延遲進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)最佳延遲大約在 1835 181。實(shí)驗(yàn)中選用一種常見(jiàn)的光動(dòng)力治療藥物亞甲基藍(lán)（ MB）作為模型 分子 ，所選用的癌細(xì)胞為人體乳腺癌（ Hela）細(xì)胞。整套裝置包括一套可與質(zhì)譜真 空系統(tǒng)兼容的一維傳動(dòng)桿組件，并與二維平移臺(tái)配套。本文 主要包括以下三個(gè)部分： 1）綜述了幾種常用的生物質(zhì)譜方法及其相關(guān)的 “軟 ”電離方法，重點(diǎn)描述了雙步激光質(zhì)譜法的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)和在分析領(lǐng)域的最新進(jìn)展。基于單束激光的基質(zhì)輔助激光解析 (MALDI)質(zhì)譜分析方法，已成為質(zhì)譜分析生物大分子的標(biāo)準(zhǔn)方法之一。本文介紹的是另一種新的激光質(zhì)譜分析方法：與 MALDI相比，雙步激光質(zhì)譜法 (L2MS)采用兩束激光分別完成氣化 /解析和電離的任務(wù)。 2）實(shí)驗(yàn)儀器系統(tǒng)：在原有超聲分子束光電離質(zhì)譜裝置的基礎(chǔ)上，自主搭建一套基于雙步激光質(zhì)譜方法的實(shí)驗(yàn)裝置。組件的末端安裝有樣品承載平臺(tái)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用 1064 nm的紅外激光對(duì)純腫瘤組織樣品進(jìn)行解析，同時(shí)用 118 nm真空紫外激光對(duì)其進(jìn)行單光子軟電離，獲得的質(zhì)譜圖背景簡(jiǎn)單，樣品中組織的質(zhì)譜信號(hào)主要來(lái)自于組 織中的氨基酸或者短肽的碎片，質(zhì)量數(shù)主要在 100 Da以下。s。s. For L2MS, the detection of in situ drugs in tissue is one of the most distinguishing features and the limit of detection (LOD) for this method is estimated to be lower than 106mol/L. KEY WORDS: TOFMS。世界上第一臺(tái)質(zhì)譜儀是于 1910年由英國(guó)物理學(xué)家 J. J. Thomson 研制成功，當(dāng)時(shí)的質(zhì)譜儀只是一種沒(méi)有進(jìn)行聚焦的拋物線質(zhì)譜裝置。日本學(xué)者 Tanaka最先提出應(yīng)用單束激光開(kāi)展基質(zhì)輔助激光解析 (MALDI)質(zhì)譜分析方法。眾所周知，質(zhì)譜已用于研究許 多國(guó)際最前沿的熱點(diǎn)問(wèn)題，在基因及基因組學(xué)、蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)組學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)藥學(xué)以及病毒學(xué)等研究領(lǐng)域中成為不可替代的有力工具，例如多肽和蛋白質(zhì)分析，細(xì)菌分析、藥物的裂解研究以及病毒檢測(cè)。傅里葉變換 離子回旋共振質(zhì)譜儀可以和多種離子源結(jié)合使用，如電子轟擊、快原子轟擊、基質(zhì)輔助激光解離、電噴霧、熱噴霧等。比如，由于維護(hù)超導(dǎo)磁場(chǎng)必須使用大量的液氮，費(fèi)用較高；離子運(yùn)動(dòng)的模式還無(wú)法用精確的數(shù)學(xué)模型加以描述。 離子阱最主要的優(yōu)點(diǎn)是能夠方便地進(jìn)行多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜 MSn 測(cè)量。四極桿質(zhì)譜可以作為分析儀器，也可以作為濾質(zhì)器，用于對(duì)一定荷質(zhì)比離子的選擇。 飛行時(shí)間質(zhì)量分析器的基本原理： 荷 質(zhì) 比不同的離子通過(guò)加速區(qū)加速，獲得相同的動(dòng)能 K后進(jìn)入一段長(zhǎng)度為 L 的無(wú)場(chǎng)飛行區(qū)，離子由于荷 質(zhì) 比不同，而獲得不同的飛行速度，荷 質(zhì) 比小 (大 )的離子速度快 (慢 )，那么通過(guò)一定距離 L 的飛行后，將先后到達(dá)檢測(cè)區(qū)被檢測(cè)。 2. 靈敏度高 : 可檢測(cè) 1018 克 的 樣品。直管飛行時(shí)間質(zhì)譜儀主要由直管飛行時(shí)間質(zhì)譜儀主要由離子源區(qū)、 自由飛行區(qū)和離子探測(cè)器三部分組成。得到離子飛行時(shí)間譜后即可反推出各種質(zhì)量數(shù)離子的分布。 反射飛行時(shí)間質(zhì)譜儀主要由離子源區(qū)、漂移區(qū)、離子反射器和離子探測(cè)器四個(gè)部分組成。因而反射飛行時(shí)間質(zhì)譜 儀的分辨率比直管飛行時(shí)間質(zhì)譜的分辨率要高很多，一般都在一千以上，甚至可以達(dá)到兩萬(wàn)左右。該技術(shù)的出現(xiàn)使 TOFMS 進(jìn)入一個(gè)前所未有的快速發(fā)展階段。 圖 11 電噴霧電離的原理圖 Figure 11 The schematic of the electrospray ionization 其基 本原理：如圖 1–1 所示，將溶于極性溶劑中的樣品混合液注入噴霧毛細(xì)管中，在毛細(xì)管與質(zhì)譜大氣壓接口采樣板之間施加一高電壓（ 2~5kV），極性溶液在強(qiáng)電場(chǎng)的作用下發(fā)生電泳現(xiàn)象，分離溶液中的正負(fù)離子，例如在正離子模式雙步激光質(zhì)譜法對(duì)動(dòng)物組織中藥物分子的原位檢測(cè) 5 下，溶液中正離子向針尖聚積，在強(qiáng)電場(chǎng)的牽引下，針尖處的液體表面向外擴(kuò)展而形 “Taylor錐 ”，隨著 Taylor 錐尖處的溶劑揮發(fā)和正電荷的聚集增加，過(guò)剩的正電荷克服液體表面張力形成小液滴，最終從 Taylor 錐體的尖端濺射出來(lái)。 電噴霧電離質(zhì)譜對(duì)于高分子化合物的測(cè)定由于可以產(chǎn)生多電荷峰，與傳統(tǒng)的質(zhì)譜相比擴(kuò)大了檢測(cè)的分子質(zhì)量范圍，同時(shí)提高了靈敏度，在 pmol數(shù)量級(jí)的水平或更少的樣品監(jiān)測(cè)中，當(dāng)分辨率 1000時(shí)刻達(dá)到 %的精度。 基質(zhì)輔助激光解吸電離 (MatrixAssisted Laser Desorption/ Ionization,MALDI） MALDITOFMS（基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜）是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型的軟電離生物質(zhì)譜，其無(wú)論是在理論上還是在設(shè)計(jì)上都是十分簡(jiǎn)單和高效的。 MALDI的原理如圖 12所示：用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離 過(guò)程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過(guò)程，離子在電場(chǎng)作用下加速飛過(guò)飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而被檢測(cè)即測(cè)定離子的質(zhì)荷比與離子的飛行時(shí)間成正比 ，檢測(cè)離子。由于 MALDI對(duì)于雜質(zhì)的忍耐性及其高靈敏度，使其也成為低聚核苷酸分析的有效方法 [3233]。此外，在電離過(guò)程中基質(zhì)產(chǎn)生的碎片離子峰極有可能覆蓋需要探測(cè)的小分子離子峰。第一束激光一般采用光子能量較小的紅外波段的激光 [3940]，但為了特殊需要，也有使用紫外激光 [41]。的氣團(tuán)，包含在該氣團(tuán)中的大部分為中性粒子，其中性粒子所占的比例大約是 帶電粒子的 1000 倍以上 [5]。同時(shí)對(duì)于小分子的探測(cè)有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可以避免基質(zhì)背景峰的干擾。 最近， Zare 等詳細(xì)探討了該質(zhì)譜分析方法應(yīng)用于定性和半定量分析中的各種因素對(duì)分析結(jié)果的影響 [46]。兩套實(shí)驗(yàn)裝置主要包括以下四部分：質(zhì)譜系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、激光光電離系統(tǒng)和同步時(shí)序控制系統(tǒng)。高真空的環(huán)境可以使腔體中空氣等雜質(zhì)的含量達(dá)到 106mol的數(shù)量級(jí)，從而大量的減少了試驗(yàn)中粒子的碰撞，并且在高真空的情況下可以降低實(shí)驗(yàn)中的本地噪聲，提高質(zhì)譜儀的信噪比和靈敏度。在本實(shí)驗(yàn)中束源室的體積大約為 25 L, 腔體的底部依次裝有氣動(dòng)閘板閥、分子泵、電動(dòng) 擋板閥和前級(jí)機(jī)械泵。下面我們主要來(lái)說(shuō)明一下脈沖閥的工作原理。試驗(yàn)中可 以通過(guò)調(diào)節(jié)脈沖電壓來(lái)開(kāi)啟時(shí)間（脈寬）以及載氣的氣壓來(lái)調(diào)節(jié)樣品的進(jìn)樣量，從而調(diào)節(jié)信號(hào)強(qiáng)度。當(dāng)脈沖閥調(diào)節(jié)到最佳狀態(tài)時(shí)，放進(jìn)合適的墊片，將脈沖閥擰緊即可。 主腔體 主腔體包括離子透鏡區(qū)、自由飛行管和離子檢測(cè)區(qū)三個(gè)重要的部分，其高真空度十分重要，一方面高真空度可以降低噪聲信號(hào)，提高質(zhì)譜儀的信噪比和靈敏度，另一方面也為 MCP的正常 工作提供了環(huán)境。脈沖閥工作時(shí)電離區(qū)的真空度一般保持在 105 Pa左右，停止工作時(shí)其真空度保持在 105 Pa左右。 雙步激光質(zhì)譜法對(duì)動(dòng)物組織中藥物分子的原位檢測(cè) 16 如圖 21 在超聲分子束的實(shí)驗(yàn)中， P1與 P2兩塊電極板上分別加 1600V、 1100v的直流高壓。 P1， P2， P4所加的直流電壓可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)，但一般變化不大。 超聲分子束和雙步激光質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)中離子的檢測(cè)是通過(guò)三片串聯(lián)的微通道板MCP來(lái)完成。m ，傾角約為 10度 的微通道，每一個(gè)通道相當(dāng)于一個(gè)電子 倍增管，當(dāng)帶電粒子以一定的初速度撞擊通道管壁后，會(huì)溢出數(shù)個(gè)電子，溢出的電子在通道內(nèi)反復(fù)撞擊管壁會(huì)產(chǎn)生更多的電子。最后將進(jìn)樣裝置固定在末端的電機(jī)上。 圖 22 雙步激光質(zhì)譜法的進(jìn)樣系統(tǒng)示意圖 Figure 22 The schematic of the sample transferred assembly Gate Valve XY Stage Ball Vavle Motor To vacuum pump 雙步激光質(zhì)譜法對(duì)動(dòng)物組織中藥物分子的原位檢測(cè) 18 光電離離子源 超聲分子束和雙步激光實(shí)驗(yàn)所采用的激光器都是納秒量級(jí)的。s 左右。 118nm真空紫外激光光源 為了獲得紫外 特別是真空紫外至軟 X射線波段的相干輻射，有很多種途徑，例如通過(guò)同步輻射、用高壓燈泵浦或者使用氣態(tài)介質(zhì)通過(guò)非線性效應(yīng)獲得入射輻射的高次諧波或和頻產(chǎn)生， 但是由于高壓燈泵浦的能量不穩(wěn)定性以及同步輻射的設(shè)備的限制， 在一般的實(shí)驗(yàn)室中使用稀有氣體產(chǎn)生真空紫外激光成為一種很普遍的方法。氣態(tài)介質(zhì)是一種各向同性介質(zhì)，具有空間反演對(duì)稱性，當(dāng)入射波的兩個(gè)電矢量反向時(shí)，宏觀極化強(qiáng)度矢量也應(yīng)反向。因而一般產(chǎn)生三級(jí)非線性光學(xué)效應(yīng) 的介質(zhì)多是氣態(tài)介質(zhì)。因此，三倍頻輻射只有在特定氣體的有限波長(zhǎng)范圍內(nèi)才能產(chǎn)生。 本文單光子激發(fā)路徑選擇了 VUV 118 nm（ ）輻射。圖 25和 26分別是 超聲 分子束和雙步激光質(zhì)譜系統(tǒng)的時(shí)序控制示意圖。在雙步激光系統(tǒng)中，由于兩束光及脈沖電壓的使用使得時(shí)序控制更為復(fù)雜些。在 465 181。s 。 圖 25 分子束時(shí)序控制示意圖 Figure 25 The schematic of time sequential control system in molecular beam 圖 26 雙步激光質(zhì)譜時(shí)序控制示意圖 Figure 26 The schematic of time sequential control system in L2MS 觸發(fā) 激光 1Q TQ=T0+442181。在觸發(fā)第一束解析激光的 Qswitch后的 18 181。s 后觸發(fā)激光的Nd： YAG（ 355nm） Gas Cell（ Ar/Xe 10:1） Quartz lens MgF2 Lens 118nm laser 雙步激光質(zhì)譜法對(duì)動(dòng)物組織中藥物分子的原位檢測(cè) 20 Qswitch。在本實(shí)驗(yàn)中三倍頻產(chǎn)生方案如下圖 23所示： 圖 23 真空紫外激光實(shí)驗(yàn)裝置示意圖 Figure 23 The schematic for the generation of 118 nm radiation 時(shí)序控制系統(tǒng) 在超聲分子束和雙步激光試驗(yàn)中，分子束、離子透鏡、激光等何時(shí)開(kāi)始工作，何 時(shí)停止工作，工作時(shí)的狀態(tài)如何，這些都需要時(shí)序控制系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控。常見(jiàn)的三倍頻氣體及其產(chǎn)生的三倍頻波長(zhǎng)有Hg原子蒸氣中產(chǎn)生 184 nm附近的波長(zhǎng) [2]， (CH3)I中產(chǎn)生 201 nm[3]， Kr中產(chǎn)生 112 nm[4]， Xe中產(chǎn)生 nm[56]等。 雙步激光質(zhì)譜法對(duì)動(dòng)物組織中藥物分子的原位檢測(cè) 19 利用氣態(tài)介質(zhì)做非線性介質(zhì)有三個(gè)重要原因：這些介質(zhì)在短波長(zhǎng)的部分區(qū)域是高度透明的，即不存在共振吸收等效應(yīng)；利用反常色散獲得位相匹配是可能的，按一定比例混合某種色散性質(zhì)相反的介質(zhì)作為緩沖劑，使混合氣體實(shí)現(xiàn)位相匹配，從而達(dá)到最佳的轉(zhuǎn)換效率；以及它們?cè)诠舱窈蜏?zhǔn)共振條件下有高非線性極化系數(shù)（由非線性極化率表達(dá)式可看出，共振增強(qiáng)效應(yīng)將大大增大極化率） [1]。于是，在電偶極近似下，具備反演對(duì)稱性的介質(zhì)中都不易發(fā)生二級(jí)非線性光學(xué)效應(yīng)。由于一般晶體在這些波段存在強(qiáng)的吸收，氣態(tài)介質(zhì)似乎是更有競(jìng)爭(zhēng) 力，其明顯的優(yōu)點(diǎn)是：在大范圍內(nèi)有很好的光學(xué)質(zhì)量，在高強(qiáng)度下不會(huì)受到不可逆損傷，并且對(duì)紫外和紅外有很好的透明性。 1064 nm基頻激光經(jīng)過(guò)三倍頻得到 355 nm的激光，用來(lái)產(chǎn)生 118 nm電離激光。 1064nm激光光源 本實(shí)驗(yàn)室所用的是泵浦激光器一臺(tái)是光 泵浦摻銣釔鋁石榴石固體激光器。這樣，在樣品的傳 送過(guò)程中真空可以得到有效地保持。 P1排斥 P2加速 P3接地 偏轉(zhuǎn)組合 P4聚焦 P5 P7 P6 P8 MCP 探測(cè)器 雙步激光質(zhì)譜法對(duì)動(dòng)物組織中藥物分子的原位檢測(cè) 17 雙步激光的進(jìn)樣系統(tǒng) 在雙步激光電離與質(zhì)譜儀的接口上，一般采用進(jìn)樣桿模式 ,如圖 22所示：即一個(gè)與質(zhì)譜真空系統(tǒng)兼容的一維傳動(dòng)桿實(shí)驗(yàn)裝置，并配有二維平移臺(tái)，末端有樣品 承載平臺(tái)。 MCP是一種高電阻率的薄壁玻璃管組成的電子倍增裝置。飛行管為無(wú)場(chǎng)區(qū)域，離子進(jìn)入此區(qū)域可以自由飛行，并最終到達(dá)檢測(cè)器。則， P1與 P2為粒子引出區(qū)， P2與 P3之間為離子加速區(qū)。與光學(xué)透鏡的功能類似，離子透鏡作用在離子上，使離子按照一定的軌跡飛行，它主要包括飛行加速區(qū)和聚焦區(qū)以及軌道偏轉(zhuǎn)區(qū)組 成。和束源室類似，主腔體在電離區(qū)下部依 次裝有：氣動(dòng)閘板閥、分子泵、電動(dòng)的擋板閥和前級(jí)機(jī)械泵。實(shí)驗(yàn)中，一般采用第二種優(yōu)化的方法，用氦氣作為載氣，壓強(qiáng)一般為 Pa，脈沖閥的頻率為 10Hz，脈寬的一般在 2004