【正文】 28a（+）表達載體， DH5α， BL21(DE3)。蛋白質(zhì)中含有的組氨酸越多，與Ni2+結(jié)合的特異性就越高，則將其洗脫下來會需要更高的咪唑濃度。 His Tag 純化操作實例本實驗室中所用的表達載體pET28a（+）中含有一個編碼多聚組氨酸的序列，即HisTag，因此會獲得帶有HisTag的重組目標(biāo)蛋白。（10）壓力腔的空氣一定要完全排出，否則當(dāng)樣品完全排出時，造成活塞與壓力池底座直接接觸，造成損傷，由于壓力非常大，有可能導(dǎo)致活塞或壓力池底座變形，造成永久性損傷！（11）在搬動裝好的樣品池時，一定要雙手，一手扶住住高壓腔，一手托住底座，防止底座脫落而造成事故。（6）嚴(yán)禁使活塞桿下至安全線以下，否則會導(dǎo)致活塞桿與底座損壞。（3）壓力的升高或降低速度要控制在一定范圍內(nèi)。將各部分拆開，徹底清洗。（7）取一冰預(yù)冷的離心管（或者將離心管至于冰中）置于樣品噴射管出口處，輕輕逆時針轉(zhuǎn)動針形閥，小心控制樣品的流出速度，根據(jù)破碎程度決定流速（建議在噴射管出口處接一個1cm長的透明的塑料管如輸液管，通過觀察塑料管流出樣品的透明度來判斷破碎是否完全）。將固定夾固定于支持桿上，擰緊固定夾上的兩個螺絲以固定腔體。視樣品體積，大致估計并調(diào)整活塞桿的位置。（3）高壓破碎是大量的破碎提取細胞內(nèi)成份的首先方法，相對于超聲破碎，它具有過程溫和，操作迅速等優(yōu)點，具體使用需要根據(jù)具體的儀器使用說明。（3）超聲時間太長、功率太高對蛋白活性肯定有影響。（6）SDSPAGE 分析蛋白表達情況。對于一些蛋白酶敏感的目的蛋白，可以在整個操作過程中加入一些蛋白酶抑制劑?！?誘導(dǎo)后的菌液收集菌體，然后視菌體的量加入300～500μl的緩沖液重懸細胞，然后置于冰上超聲破碎。 5%濃縮膠的配置Gel%組成所需要各成份體積（ml）1234565%水30%丙烯酰胺溶液()10%SDS10%過硫酸氨TEMEDTip：染色前可將染色液在微波爐里加熱至沸，然后搖床震蕩染色約10min即可。上樣用微量移液器上樣，每加入一種樣品，上樣量根據(jù)根據(jù)具體的樣品濃度確定，未知濃度一般用10微升。（5）灌注積層膠，立即插入干凈的梳子，避免產(chǎn)生氣泡。（2）配制10%的分離膠（具體參考表2）：迅速在兩玻璃板間隙中灌注分離膠，直至剩余的板寬比梳子長度多1cm。（8）5Tris甘氨酸電極緩沖液： Tris，94g甘氨酸和5g SDS定容到1000ml（建議每次電泳用新稀釋的緩沖液）。（4）10%過硫酸銨：新鮮配制?？烧J為聚丙烯酰胺無毒，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因為它還可能會含有少量未聚合材料。（1）30%丙烯酰胺貯存液：29g丙烯酰胺和1g N,N’亞甲雙丙烯酰胺溶于100ml熱水中。對于一些蛋白可能無法實現(xiàn)可溶性表達，這時候溶解包涵體后再純化是唯一的解決辦法。若目標(biāo)蛋白的表達主要分布于沉淀，則可以嘗試一下幾種方法來改善表達。再加入300～500ml PBS重懸細胞。很多外源基因在大腸桿菌表達時很容易形成不可容的包涵體，其原因可能有：表達量過高，研究發(fā)現(xiàn)在低表達時很少形成包涵體，表達量越高越容易形成包涵體；蛋白合成速度太快，以至于沒有足夠的時間進行折疊，二硫鍵不能正確配對；過多蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無法達到足夠的溶解度等。另一個需要考慮的是大腸桿菌的密碼子及其偏愛性。 （DE3）RP等。 （DE3）RIPL，BL21CodonPlμs174。擁有trxB和gor突變的菌株比單具，trxB突變的菌株更有可能促進二硫鍵的形成，使蛋白可溶性更好，活性更高。BL21（DE3）： DE3噬菌體溶源于BL21 形成的帶有染色體T7 RNA 聚合酶基因大腸桿菌。具體操作過程中，根據(jù)所使用的表達載體的特點，目的基因密碼子的組成等選擇特定的表達宿主菌。當(dāng)然，GST 具有較大的分子量（26kDa），可能對目的蛋白的活性有影響，因此很多時候切除GST是必須的。目前常使用的表達載體主要是由Novagen 提供的pET 系列和 Qiagen 公司提供的pQE 系列。常用的用于親和純化融合標(biāo)簽包括 PolyArg，PolyHis, StrepTag Ⅱ，Stag，MBP等。本章節(jié)介紹了實驗室常用的大腸桿菌表達系統(tǒng)的構(gòu)成特點，歸納了利用大腸桿菌表達系統(tǒng)純化重組蛋白的基本流程和詳細操作步驟，并且結(jié)合筆者的操作經(jīng)驗，總結(jié)了初學(xué)者在操作過程中可能遇到的問題和解決策略。因此熟練掌握并運用大腸桿菌表達系統(tǒng)的基本原理和常規(guī)操作是對每一個研究生來說是非常必要的。融合表達是在目標(biāo)蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促進蛋白的正確折疊，實現(xiàn)目的蛋白的快速親和純化，或者實現(xiàn)目標(biāo)蛋白的表達定位。His 標(biāo)簽具有較小的分子量，融合于目標(biāo)蛋白的N端和C端不影響目標(biāo)蛋白的活性，因此純化過程中大多不需要去除。此外，與His 相比，GST 很多時候能夠促進目標(biāo)蛋白的正確折疊，提高目標(biāo)蛋白表達的可溶性，因此，對于那些用his 標(biāo)簽表達易形成包涵體的蛋白，可以嘗試用GST融合表達來改進。作為表達宿主菌必須具備幾個基本特點：遺傳穩(wěn)定，生長速度快，表達蛋白穩(wěn)定。適用于Tac，Trc，Lac，λPL，cspA等作為啟動子的載體。比如：Origami （DE3），Origami B（DE3）和Rosettagami （DE3）菌株帶有 trxB和gor雙突變。BL21Codon Plus系列：包括BL21CodonPlus174。RP，BL21 CodonPlus174。M15/SG13009：自身表達T5 RNA polymerase，主要用于pQE系列載體的表達。與實現(xiàn)外源蛋白的穩(wěn)定表達相比，更多時候保證目標(biāo)蛋白的可溶性表達，是建立表達條件的主要工作。將取出的1ml 菌液12000 rpm 離心1min，收集菌體，加入1ml PBS 緩沖液重懸沉淀，同樣離心1min。若在上清中有明顯的目的蛋白的條帶，即可以放大培養(yǎng)進而純化目標(biāo)蛋白。嘗試一些特殊設(shè)計的表達宿主Origami：thioredoxin redμctase/glμtathione redμctase 雙突變適合帶thioredoxin redμctase的融合表達載體，幫助形成更多的二硫鍵。本小節(jié)列出SDSPAGE 操作中一些試劑的配置及其基本的操作過程。稱量丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺時應(yīng)戴手套和面具。（3）10% SDS溶液：SDS 加入ddH2O ToTo100。（7）2樣品溶解液：2%SDS，5%巰基乙醇，10%甘油，%溴酚藍，（）緩沖液。凝膠制備（1）安裝洗滌干凈的玻璃板、板條，并將玻璃板固定在電泳槽中。（4）分離膠聚合完全后，倒去異丙醇或水，用濾紙吸干膠面上的殘余。樣品的制備在蛋白溶液中加入等體積的2樣品溶解液，混合液在沸水浴中加熱5min，冷卻后即可上樣。后處理（1）染色：加入染色液（用量同上），室溫染色30min～1h。表2. 配制SDSPAGE 不同濃度分離膠的配置不同體積（ml）凝膠液中各成分所需體積（ml）Gel%組成所需要各成份體積（ml）510152025306%水30%丙烯酰胺溶液123456()510%SDS10%過硫酸氨TEMED8%水30%丙烯酰胺溶液48()510%SDS10%過硫酸氨TEMED10%水430%丙烯酰胺溶液510()510%SDS10%過硫酸氨TEMED12%水30%丙烯酰胺溶液24681012