分子生物學常用技術及其應用-全文預覽
【正文】 （四）標記方法 ?體內(nèi)標記法：將標記物摻入培養(yǎng)基 ?體外標記法：化學法或酶法 第三節(jié) 聚合酶鏈反應 polymerase chain reaction ?聚合酶鏈反應（ PCR） —— 體外 高效、快速、特異 地擴增 目的基因或 DNA片段的技術。 一、核酸分子雜交的基本原理 ?探針核酸分子與變性的被檢核酸分子復性，通過堿基互補的原則，形成雜交分子。 ?免疫學法：利用特異性抗體與基因表達產(chǎn)物結(jié)合的方法。 ? 用滅活的噬菌體或病毒的蛋白質(zhì)外殼包裹重組的DNA分子 ， 使其進如宿主細胞 。 平末端連接 在 T4 DNA連接酶的作用下，直接連接 DNA平端末端，效率較低。 5． 利用 PCR合成： (聚合酶鏈反應 ） ?如已知目的基因兩端的序列 ，則可采用聚合酶鏈反應（ polymerase chain reaction,PCR ）技術 ， 在體外合成目的基因 。 這一方法通?？傻玫娇杀磉_的完整基因 。 五、重組 DNA技術的基本過程 （ 一 ） 制備目的基因和載體； （ 二 ） DNA的重組； （ 三 ） 重組 DNA導 入宿主細胞 （ 四 ） DNA重組體的篩選和鑒定 （ 五 ） DNA重組體的 擴增和表達 （ 一 ） 目的基因的 制備： 目的基因的篩選和分離可采用以下方法進行： 1． 直接從染色體 DNA中分離： ?僅適用于原核生物基因的分離，較少采用。 ? 生物技術 —— 包括基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細胞工程。 ? 基因工程 —— 采用人工方法將不同來源的 DNA進行重組，并將重組后的 DNA引入宿主細胞中進行增殖或表達的過程。 ?DNA連接酶 ?DNA聚合酶 ?逆轉(zhuǎn)錄酶多核苷酸激酶 ?堿性磷酸酶 ?末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 三、載體 ?載體必須符合以下幾點要求： （ 1）能在宿主細胞內(nèi)復制并具有較高的拷貝數(shù) （ 2）容易進入宿主細胞 （ 3）具有多個限制性核酸內(nèi)切酶單一的酶切位點 （ 4）容易從宿主細胞中分離純化 （ 5）有容易被識別篩選的標志 ? 常用的載體包括：質(zhì)粒、 λ 噬菌體、粘粒、病毒 由質(zhì)粒與 λ噬菌體構(gòu)成 四、重組 DNA技術的基本原理 制備 DNA片段，并通過載體將其導入受體細胞，在受體細胞中復制、擴增，以獲得單一 DNA分子的大量拷貝。 3 ． 從 mRNA 合成cDNA： 采用一定的方法釣取特定基因的mRNA， 再通過逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成其 互補 DNA（ cDNA ） ， 除去 RNA鏈后 ， 再用 DNA聚合酶合成其互補 DNA鏈 ，從而得到雙鏈DNA。 C文庫具有組織細胞特異性 。 同
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