凝膠遷移實驗-全文預(yù)覽
【正文】 突變探針： 1微升。（6）總體積 ：10微升。（2）EMSA/GelShift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。（3）細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 ：2微升。（4）標(biāo)記好的探針 ：1微升。如果發(fā)現(xiàn)非常容易形成氣泡，可以把一塊制膠的玻璃板進行硅烷化處理。為得到更好的結(jié)果，可以選擇可灌制較大 EMSA 膠的模具。標(biāo)記好的探針可以保存在 20℃。小心吸去殘余液體?！嬷?0℃沉淀1小時，或在20℃沉淀過夜。為實驗簡便起見，通常不必測定探針的標(biāo)記效率。實驗步驟：探針的標(biāo)記 → 探針的純化 → EMSA膠的配制 → EMSA結(jié)合反應(yīng) → 電泳分析一、探針的標(biāo)記；，37℃反應(yīng)10分鐘；，混勻，終止探針標(biāo)記反應(yīng)。這一技術(shù)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白，目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常標(biāo)記的效率在30%以上，即總放射性的30%以上標(biāo) 記到了探針上。 二、 探針的純化，加入1/4體積即25微升的5 M醋酸銨，再加入2體積即200微升的無水乙醇，混勻?！?，12 000 g16 000 g離心1分鐘。標(biāo)記好的探針最好立即使用，最長使用時間一般不宜超過3天。最好選擇可以灌制較薄膠的模具，以便于干膠等后續(xù)操作。避免產(chǎn)生氣泡， 并加上梳齒。（3）細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子： 0微升。（2）EMSA/GelShift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。 探針冷競爭反應(yīng)：（1）NucleaseFree Water ：4微升。（5）標(biāo)記好的探針： 1微升。（3）細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 ：2微升。（2）EMSA/GelShift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。（6）總體積 ：10微升。注意：有些時候溴酚藍會影響蛋白和DNA的結(jié)合，建 議盡量使用無色的EMSA/GelShift上樣緩沖液。預(yù)電泳的時候如果有空余的上樣孔，可以加入少量稀釋好
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