【正文】 二、固定化酶的制備技術(shù) （一）固定化酶的制備 （二）固定化酶的形狀和性質(zhì) （三）固 定化酶的活力測定方法 三、固定化細(xì)胞的制備技術(shù) 固定化細(xì)胞的制備 固定化細(xì)胞的形狀和性質(zhì) 四、固定化生物反應(yīng)器 酶反應(yīng)器 ?用于酶催化反應(yīng)的裝置稱為酶反應(yīng)器， ?它可用于溶液酶、也可用于固定化酶。 55mol 的 NaCl 溶液中 24 ↓ 經(jīng) 4000r/min 離心 15 分鐘，洗滌 23次，離心，棄去上清液 ↓ 菌體細(xì)胞懸浮于 SMM 緩沖液中 ↓ 加入采用 SMM 液配制的溶菌酶 1000 單位 /ml，置恒溫水浴溶解細(xì)胞壁， 定時(shí)取樣鏡檢，并用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。 課堂小結(jié)： 細(xì)胞融合技術(shù)，動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 第三部分：布置作業(yè)、說清楚作業(yè)的要求 （時(shí)間： 1分鐘） 植物體外培養(yǎng)所需要的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)有哪些？ 血清在動物系八婆培養(yǎng)中的利、弊有哪些？ 與液體培養(yǎng)細(xì)胞相比，固定化細(xì)胞有哪些？ 教學(xué)后記 22 湖 北 生 物 科 技 職 業(yè) 學(xué) 院 課 時(shí) 教 案 講 授 人 方緒鳳 課 時(shí) 2學(xué)時(shí) 序 號 課題內(nèi)容 第五章 酶工程制藥技術(shù) 第一節(jié) 第二節(jié) 教學(xué)時(shí)間 教學(xué)方法 課堂講授 教學(xué)課型 理論 □√ 實(shí)驗(yàn) □ 習(xí)題 □ 實(shí)踐 □ 復(fù)習(xí)□ 其它 □ 教學(xué)手段 采用課堂講授方式進(jìn)行，以 PPT為主，板書為輔 教學(xué)目的 學(xué)會藥物的酶法生產(chǎn) 酶和細(xì)胞的固定化原理與技術(shù) 重點(diǎn)難點(diǎn) 重點(diǎn)：酶工程的基本概念和基本技術(shù)，酶和細(xì)胞的固定化技術(shù) 難點(diǎn)：影響工程制藥酶活性的因素及工程制藥酶的來源 參考資料 《制藥工藝學(xué)》，陳平等主編，湖北 科學(xué)技術(shù)出版社， 2020 《生物制藥工藝學(xué)》第二版，吳梧桐主編 ， 中國醫(yī)藥科技出版社， 2020 《生物制藥工藝學(xué)》，陳電容，朱照靜主編，人民衛(wèi)生出版社， 2020 《生物合成藥物學(xué)》，褚志義主編 ， 化學(xué)工業(yè)出版社， 2020 教學(xué) 進(jìn)程 第一部分：組織教學(xué)和復(fù)習(xí)上次課主要內(nèi)容 （時(shí)間： 5分鐘） 一、情境導(dǎo)入 ： 設(shè)計(jì)意圖： 第二部分：學(xué)習(xí)新內(nèi)容 （時(shí)間： 84鐘） 第五章 酶工程制藥技術(shù) 第一節(jié) 概論 一、酶的特性 酶的定義和分類 酶是生物體內(nèi)具有生物催化功能的生物大分子，包括蛋白質(zhì)和核酸等。 三、 培養(yǎng)細(xì)胞的生存條件 ?培養(yǎng)細(xì)胞所需營養(yǎng)物質(zhì) 基本營養(yǎng)：與體內(nèi)相同，包括糖、氨基酸、無機(jī)離子、維生素、微量元素（ 1640，F(xiàn)10， F12， DMEM 等等） 生長因子：動物血清（小牛血清，胎牛血清） 基本培養(yǎng)液（ 80～ 90％）血清（ 10～ 20％） 抗生素：雙抗（青霉素 鏈霉素）終濃度為每毫升 100 單位 特殊條件：高糖、胰島素、 PHA?? 根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)特殊需要 ?培養(yǎng)環(huán)境 溫度： 35~37℃ 濕度：恒濕 氣體： 95%空氣 /5%CO2， N2 酸堿度： pH ~ （酚紅指示） 滲透壓： =血漿滲透壓 290 Osm/kg 21 支持物：玻璃、塑料、飼養(yǎng)層、微載體 四、動物細(xì)胞及組織培養(yǎng) （一）灌注懸浮培養(yǎng) （二）貼壁細(xì)胞培養(yǎng) （三）固定化細(xì)胞培養(yǎng) 第四節(jié) 植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) ?植物細(xì)胞培養(yǎng)（ plant cell culture）： 指對植物器官或愈傷組織上分離出來的單細(xì)胞 (或小細(xì)胞團(tuán) )進(jìn)行培養(yǎng)，形成單細(xì)無性系或再生植物的技術(shù)。大多數(shù)細(xì)胞屬此型。 第三部分：布置作業(yè)、說清楚作業(yè)的要求 （時(shí)間： 1分鐘） 有關(guān)名詞解釋 雜交瘤技術(shù) 單克隆抗體 細(xì)胞融合技術(shù) 原生質(zhì)體融合 簡述分離細(xì)胞的方法。 (一 ) 原生質(zhì)體的制備： 材料來源與預(yù)處理： （ 1）材料來源： （ 2）預(yù)處理： 2. 制備原生質(zhì)體的酶類： 3．原生質(zhì)體分離及純化 4．原生質(zhì)體活力測定 （二）原生質(zhì)體培養(yǎng)： 18 1. 培養(yǎng)方法： （ 1）固體培養(yǎng)：平板培養(yǎng)法， 1. 2%瓊脂。 三、植物原生質(zhì)體融合和體細(xì)胞雜交 植物原生質(zhì)培養(yǎng)和細(xì)胞融合可用產(chǎn)生遠(yuǎn)緣雜種；是目前植物細(xì)胞及基因工程的核心技術(shù)。 （二）細(xì)胞融合研究進(jìn)展 ? 教師活動： 以時(shí)間為軸介紹細(xì)胞融合研究發(fā)展的過程 細(xì)胞融合的意義 二、動物細(xì)胞融合和體細(xì)胞雜交 （一）促進(jìn)細(xì)胞融合的方法 仙臺病毒法 聚乙二醇（ PEG）法 電融合法 （二）雜交瘤技術(shù) 概念：只針對某一抗原決定簇的抗體分子稱為單克隆抗體。 結(jié)合本章基因工程藥物探討分析艾滋病基因工程疫苗的制備思路。 第三節(jié) 基因工程工具酶和載體 一、 基因工程的常用酶 14 教學(xué) 進(jìn)程 （續(xù)） （一） 限制性內(nèi)切酶 （二） 連接酶 （三） 其他基因工程工具酶 二、 常用的克隆載體 （一） 概述 （二） 克隆載體 三、 基因工程中常用的表達(dá) 系統(tǒng) （一） 原核表達(dá)體系 大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng) 芽孢桿菌 鏈霉菌 （二） 真核生物表達(dá)體系 酵母表達(dá)體系 昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系 植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) （三） 轉(zhuǎn)基因植物 （四） 轉(zhuǎn)基因動物 ? 教師活動 ： 學(xué)習(xí)目的基因的獲得、載體的選擇、目的基因和載體的連接等方法時(shí)，在此基礎(chǔ)上了解重組載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞、重組子的篩選、目的基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)、基因工程藥物的分離純化方法。目的 DNA能否高效表達(dá)，除與 表達(dá)載體自身特點(diǎn)及誘導(dǎo)條件 (如溫度、 pH和誘導(dǎo)物等 )有關(guān)外，還取決于受體細(xì)胞容許目的 DNA表達(dá)的多個(gè)層次 。目前我國已批準(zhǔn) 15種基因工程藥物和疫苗上市，在研究開發(fā)中的也有 10余種。 3. 按基因工程藥物作用機(jī)理也可分為三類，其一 , 蛋白或多肽藥品 。 第二部分：學(xué)習(xí)新內(nèi)容 （時(shí)間： 84鐘） 11 教學(xué) 進(jìn)程 （續(xù)） 第三章 基因工程制藥技術(shù) 第一節(jié) 概述 一、基因工程制藥 傳統(tǒng)制藥存在的問題： A、材料來源困難或制造技術(shù)問題而無法付諸應(yīng)用； B、從動物臟器中提取出來，也因造價(jià)太高，或因來源困難而供不應(yīng)求； C、由于免疫抗原等緣故，使它們在使用上受到限制。 課堂小結(jié)： 微生物發(fā)酵制藥需要的工藝條件及其控制方法 ? 學(xué)習(xí)方法體會 ： 學(xué)習(xí)滅菌操作技術(shù)時(shí)，必須知道滅菌的方法主要包括化學(xué)滅菌、輻射滅菌、熱滅菌、過濾除菌等四種，同時(shí)要清楚各種滅菌方法的適用范圍。 課堂小結(jié)： 制藥用微生物將會通過圖片形式詳細(xì)給學(xué)生做個(gè)講解，并且加以總結(jié)。 發(fā)酵工 程制藥的特點(diǎn) 發(fā)展趨勢 利用 DNA重組技術(shù)和細(xì)胞工程技術(shù)的發(fā)展、新的工程菌和新型微生物的開發(fā) 新型的生理活性多肽和蛋白質(zhì)類藥物：干擾素、白介素促紅細(xì)胞生成素等； 新型菌體制劑和疫苗。 深層培養(yǎng)、生產(chǎn)大規(guī)?；?、多種抗生素、氨基酸、核酸發(fā)酵成功。 生物藥物有哪些作用特點(diǎn)？ DNA重組藥物主要有哪幾類？舉例說明之。 2. 近代生物制藥發(fā)展階段 （ 1）臟器制藥與微生物制藥時(shí)期 （ 2）生化制藥工業(yè)時(shí)代 3. 現(xiàn)代生物制藥階段 ： 特點(diǎn)是以基因工程為主導(dǎo)，包括細(xì)胞工程、發(fā)酵工程、酶工程和組織工程為技術(shù)基礎(chǔ)。對多種物理、化學(xué)、生物學(xué)因素不穩(wěn)定。 治療針對性強(qiáng) ,基于生理生化機(jī)制。早期的制藥幾乎都是化學(xué)合成的。直到 1930年代，制藥工業(yè)才開始 大發(fā)展。 現(xiàn)代生物藥物的分類 參考資料 《生物制藥工藝學(xué)》，陳電容，朱照靜主編，人民衛(wèi)生出版社， 2020 《制藥工藝學(xué)》，陳平等主編，湖北科學(xué)技術(shù)出版社， 2020 《生物制藥工藝學(xué)》第二版，吳梧桐主編 ， 中國醫(yī)藥科技出版社， 2020 《生物合成藥物學(xué)》，褚志義主編 ， 化學(xué)工業(yè)出版社， 2020 教學(xué) 進(jìn)程 第一部分：組織教學(xué)和復(fù)習(xí)上次課主要內(nèi)容 （時(shí)間： 5分鐘） 情境導(dǎo)入 ： 制藥工業(yè)的 歷史大約只有 60 多年，但從開始就發(fā)展很快，目前全世界制藥企業(yè)超過 10000 家，生產(chǎn)制造 5000 多種藥物，其中約 100 家為跨國公司。 了解生物藥物的現(xiàn)狀和發(fā)展前景。 熟悉現(xiàn)代生物藥物的分類和用途。 難點(diǎn) 生物藥物的性質(zhì)和特點(diǎn) 。 1800：阿司匹林，從而導(dǎo)致了藥物化學(xué)公司的誕生， Bayer 和 Hoechst 公司。 1940 年代大規(guī)模生產(chǎn)青霉素，此時(shí)，建立了很多現(xiàn)代的領(lǐng)頭制藥企業(yè)，如 Eli Lilly、 Welle、 2 教學(xué) 進(jìn)程 （續(xù)） Glaxo、 Roche 等。 二、生物制藥的研究內(nèi)容 發(fā)酵工程制藥 基因工程制藥 細(xì)胞工程制藥 酶工程 制藥 第二節(jié) 生物藥物的性質(zhì)與類別 一、生物藥物的性質(zhì)與特點(diǎn) （一）藥理學(xué) (pharmacology)特性： 活性強(qiáng) : 體內(nèi)存在的天然活性物質(zhì)。 (二 ) 理化特性： 1. 含量低、雜質(zhì)多、工藝復(fù)雜、收率低、技 術(shù)要求高； 2. 組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具嚴(yán)格空間結(jié)構(gòu)，才有生物活性。 （ 3）天然生物藥物 （ 4）合成或半合成生物藥物 第三節(jié) 生物制藥的發(fā)展歷史和概況 一、生物制藥的發(fā)展歷史 1. 傳統(tǒng)生物制藥技術(shù)階段 ： 指從生物材料粗加工制成粗制劑階段。 第三部分：布置作業(yè)、說清楚作業(yè)的要求 （時(shí)間： 1分鐘） 簡述生物制藥工藝學(xué)的性質(zhì)和任務(wù) 生物藥物有哪幾類？ DNA重組藥物與基因藥物有什么區(qū)別？ 生物藥物發(fā)展過程有哪幾個(gè)階段？簡述生物藥物的發(fā)展方向。 第三階段 20世紀(jì) 40年代初，第二次世界大戰(zhàn)爆發(fā)，青霉素迅速工業(yè)大規(guī)摸生產(chǎn)。 20世紀(jì) 80年代，基因工程、蛋白質(zhì)工程、細(xì)胞融合技術(shù)等高新技術(shù)應(yīng)用階段。 菌種保藏三要素 典型菌種的優(yōu)良純種的休眠體； 創(chuàng)造有利于種子休眠的環(huán)境（低溫、干燥、缺氧、避光、缺少營養(yǎng)）； 盡可能采用多種不同的手段保藏同一菌株。 第二 章 微生物發(fā)酵制藥技術(shù) 四、微生物代謝產(chǎn)物的生物合成 （一）微生物合成的初級代謝產(chǎn)物 （二）微生物次級代謝產(chǎn)物的生物合成 次級 微生物合成的次級代謝產(chǎn)物的基本特征 （ 1）次級代謝產(chǎn)物具有種特異性 （ 2）分批發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生菌生長周期有三個(gè)時(shí)期 （ 3）次級代謝產(chǎn)物不少是結(jié)構(gòu)相似的混合物 （ 4）次級代謝產(chǎn)物的合成受多基因控制 （三）微生物生物合成的主要調(diào)節(jié)機(jī)制 初級代謝產(chǎn)物生物合成中的主要調(diào)控機(jī)制 次級代謝產(chǎn)物生物合成中的主要調(diào)控機(jī)制 第三節(jié) 發(fā)酵工藝條件的確定 一、 培養(yǎng)基及其制備 （一） 培養(yǎng)基的成分 （二） 培養(yǎng)基的種類 與選擇 （三） 影響培養(yǎng)基質(zhì)量的因素 二、 滅菌操作技術(shù) （一） 滅菌原理和滅菌操作 （二） 無菌檢查與染菌的處理 三、微生物發(fā)酵的三種主要操作方式 9 分批發(fā)酵、補(bǔ)料分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵 四、發(fā)酵過程中的主要參數(shù)及控制 （一）發(fā)酵過程的主要控制參數(shù) （二）基質(zhì)對發(fā)酵的影響及補(bǔ)料的控制 （三）溫度對發(fā)酵的影響及其控制 （四） pH對發(fā)酵的影響及其控制 （五）溶氧對發(fā)酵的影響及其控制 （六）二氧化碳的影響及其控制 （七）泡沫的影響及其控制 （八） 發(fā)酵終點(diǎn)的確定 （九）異常發(fā)酵的處理 ? 教師活動： 引導(dǎo)學(xué)生舉出實(shí)際例子，并通過單個(gè)實(shí)例延伸出微生物發(fā)酵 制藥的工藝技術(shù)，及總結(jié)特點(diǎn)。 首先培養(yǎng)學(xué)生對基因工程的興趣，從實(shí)際生活出發(fā)，由淺入深，從實(shí)際應(yīng)用到理論學(xué)習(xí)。 2. 按作用方式可將基因工程藥物分為基因水平作用藥物、轉(zhuǎn)錄水平藥物、 蛋白質(zhì)水平藥物 。α 1b 型基因工程干擾素是由我國自行研制開發(fā)的具有國際先進(jìn)水平的