【正文】 速度下分析樣品需要很長時間，一般來說都選在1mm/s的條件下操作。③改善傳質(zhì)過程。在分配色譜中Hs與df的平方成正比，在吸附色譜中Hs與吸附和解吸速度成反比。固定相的顆粒越小，微孔孔徑越大，傳質(zhì)阻力就越小，傳質(zhì)速率越高。這是由于在一個流路中流路中心和邊緣的流速不等所致。3）傳質(zhì)阻抗（mass transfer resistance）。在低流速時，它對峰形的影響較大。又稱縱向擴散。大而均勻（球形或近球形）的顆粒容易填充規(guī)則均勻，λ越小。由于色譜柱內(nèi)填充劑的幾何結(jié)構(gòu)不同，分子在色譜柱中的流速不同而引起的峰展寬。 由流出曲線方程對V(0~∞)求積分，即得出色譜峰面積A。②當進樣量一定時，σ越?。ㄖг礁撸甯咴礁?，因此提高柱效能提高HPLC分析的靈敏度。 雖然以上假設(shè)與實際色譜過程不符，如色譜過程是一個動態(tài)過程，很難達到分配平衡；組分沿色譜柱軸方向的擴散是不可避免的。4） 在所有塔板上分配系數(shù)相等，與組分的量無關(guān)。它把色譜柱看作分餾塔，把組分在色譜柱內(nèi)的分離過程看成在分餾塔中的分餾過程，即組分在塔板間隔內(nèi)的分配平衡過程。高壓液相色譜HPLC培訓(xùn)教程(三) 二、塔板理論1．塔板理論的基本假設(shè)這常常是提高分離度的最容易方法，可以通過調(diào)節(jié)流動相的組成來實現(xiàn)。②增加選擇性。R＝，稱為6σ分離，%。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。 要使兩組分得到分離，必須使α≠1。α又稱為相對保留時間（《美國藥典》）。 容量因子與分配系數(shù)的不同點是：K取決于組分、流動相、固定相的性質(zhì)及溫度，而與體積Vs、Vm無關(guān)；k除了與性質(zhì)及溫度有關(guān)外，還與Vs、Vm有關(guān)。R＝0；k越大，說明固定相對此組分的容量越大，出柱慢，保留時間越長。容量因子(capacity factor，k)化合物在兩相間達到分配平衡時，在固定相與流動相中的量之比。這只是理想狀態(tài)下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增大，K減小，這時色譜峰為拖尾峰；而有時隨著溶質(zhì)濃度增大，K也增大，這時色譜峰為前延峰。實際應(yīng)用時往往用柱長L和理論塔板數(shù)計算。（一般HPLC柱的N在1000以上。在一張多組分色譜圖上，如果各組分含量相當，則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。R＝tR－t0調(diào)整保留體積(adjusted retention volume，V39。在實驗條件（溫度、固定相等）一定時，t39。又稱洗脫體積。其中只有Vm參與色譜平衡過程，其它3部分只起峰擴展作用。即流動相（溶劑）通過色譜柱的時間。標準偏差的大小說明組分在流出色譜柱過程中的分散程度。峰寬（peak width，W)峰兩側(cè)拐點處所作兩條切線與基線的兩個交點間的距離?！吨袊幍洹穨。不對稱色譜峰有兩種：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產(chǎn)生漂移。一般應(yīng)平行于時間軸。它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。 分析堿性物質(zhì)常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。主要用于分析離子強度大的酸堿物質(zhì)。pH值可改變化合物的解離程度，進而影響其與固定相的作用。 高～中正相色譜法與反相色譜法比較表 隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些無機樣品或易解離樣品的分析。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計，它占整個HPLC應(yīng)用的80%左右。 使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔體表面，或化學(xué)鍵合于擔體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。常用于分離同分異構(gòu)體。 使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對組分吸附力大小不同而分離。 高效液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。按操作形式可分為紙色譜法(PC)、薄層色譜法(TLC)、柱色譜法。GC根據(jù)固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)和氣液色譜法(GLC)，其中以GLC應(yīng)用最廣。色譜柱每米降壓為75 Kg/cm2以上。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。 色譜法的分離原理是：溶于流動相(mobile phase)中的各組分經(jīng)過固定相時，由于與固定相(stationary phase)發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出。*參考(標準JB522691)液相色譜儀測試用標準色譜柱。 柱性能測試： 因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。如使用UV檢測器，最好使用對紫外吸收較低的溶劑配制。 c、流動相的黏度要盡量小，以便在使用較長的分析柱時能得到好的分離效果；同時降低柱壓降，延長液體泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。 液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點： a、最好使用流動相溶解樣品。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進行(出廠測試所使用的條件是最佳條件)，只有這樣，測得的結(jié)果才有可比性。如色譜柱通過流動相加壓后有漏液現(xiàn)象，請用扳手繼續(xù)順時針擰1／4圈，直至不漏液為止。、。 b、擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。 常用的其它的反相填料還有鍵合CCC苯基等，其顆粒粒徑在3—10 μm之間。 反相柱：主要是以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合十八烷基官能團(ODS)的非極性填料。根據(jù)外型可分為無定型和球型兩種，其顆粒直徑在3—10 μm的范圍內(nèi)。 液相色譜柱的分離作用是在填料與流動相之間進行的，柱子的分類是依據(jù)填料類型而定。3／16英寸的內(nèi)螺紋與1／16英寸()的連接管連接，中間也放置壓環(huán)用于柱接頭的密封。: 解 決 方 法(尖銳峰) : 流動相脫氣,加柱后背壓 (隨機噪聲) : 清洗柱,凈化樣品,用HPLC級試劑 : 更換氘燈 (偶然噪聲) : 采用穩(wěn)壓電源,檢查干擾的來源(如水浴等) : 流動相脫氣,加柱后背壓 (七)峰拖尾可能的原因: 柱恒溫 : 至少用10倍柱體積的流動相平衡柱 : 用25mmol/L的緩沖液 : 每天沖洗柱 : 穩(wěn)定進樣條件,調(diào)節(jié)流動相 : 采用保護柱 (二)保留時間縮短可能的原因 : 解 決 方 法 : 檢查泵,重新設(shè)定流速 : 降低樣品量 : 流動相PH值保持在3~ : 防止流動相蒸發(fā)或沉淀 : 柱恒溫 (三)保留時間延長可能的原因因此，樣品進入色譜柱后，在柱子以外的任何死體積（進樣器、柱接頭、連接管、檢測器）中，樣品分子的擴散和滯留，都會引起色譜峰的展寬，而使柱效降低 。更換色譜柱時要注意什幺事項?但是在比例閥的混合點，重力作用使鹽顆粒沉淀下來，通常，閥A接水相/鹽溶液，D接有機溶劑，此法連接可有效使鹽回落到鹽溶液中，并被溶解。使用梯度比例發(fā)時要注意那些事項？（當打開Purge Valve時，壓力高于10bar，表明過濾芯已堵）。A：流動相使用前請必須脫氣、過濾。Agilent 1100LC泵如何維護？以下幾種方法可以有效防止溶劑瓶內(nèi)溶劑過濾器的堵塞。如何防止溶劑瓶內(nèi)溶劑過濾器的堵塞，以及堵塞后的處理？加熱回流法：效果較好，但操作復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染。氣泡會增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無法分析。流動相使用前為什幺要脫氣？ 毛細管線分類： 綠色 。以23滴/min的速度虹吸流下，不能干涸。尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機溶劑和水溶液，可用于強酸，70%乙醇、二氯甲烷、不適用于二甲基甲酰胺。3mm內(nèi)徑：適用于小進樣量的過濾。儀器：溶劑和樣品中的細小顆粒會增加進樣閥的堵塞和磨損，同時也會增加泵頭內(nèi)的藍寶石活塞桿和活塞的磨損。帶sealwash的 1100，要配制90%水+10%異丙醇，以每分2—3滴的速度虹吸排出，溶劑不能干涸。 退出化學(xué)工作站，及其它窗口，關(guān)閉計算機（用shut down關(guān)）。 ● (3)、單擊Ok.(3)、如積分結(jié)果不理想，則修改相應(yīng)的積分參數(shù)，直到滿意為止。 積分: 反復(fù)進行，直到圖的比例合適為止。 1等儀器Ready，基線平穩(wěn)，從Method菜單中選擇“Run method”，進樣。 區(qū)別: ● “Peak width”：大多數(shù)應(yīng)用設(shè)為4s，只有快速分析采用小的設(shè)定值。 Emission: ● 用甲醇稀釋為1:10。 若環(huán)境溫度不穩(wěn)定,則設(shè)定光學(xué)單元溫度為高于環(huán)境溫度5度,以防樣品在池中沉淀。 峰寬(響應(yīng)時間) : Off 。選中所用的燈。參比帶寬BW：至少要與樣品信號的帶寬相等，許多情況下用100nm作為缺省值。 在”Peak width (Response time)”下方點擊下拉式三角框,選擇合適的響應(yīng)時間, 如 ●點擊ok進入下一畫面。 柱溫箱參數(shù)設(shè)定: ●點擊Ok進入下一畫面?！襁x擇合適的進樣方式, 進樣體積 ,洗瓶位置為6號。 ●在“Flow”處輸入流量,如1ml/min，在“Solvent B”,(A=100B) ,也可Insert 一行”Timetable” ,編輯梯度。單擊Ok。 valve。 單擊Pump圖標，出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單，單擊Pump control選項，選中On，單擊OK，則系統(tǒng)開始Purge，直到管線內(nèi)（由溶劑瓶到泵入口）無氣泡為止,切換信道繼續(xù)Purge，直到所有要用信道無氣泡為止。 把流動相放入溶劑瓶中。 打開 1100 LC 各模塊電源。HPLC系統(tǒng)SOPWaters高效液相色譜系統(tǒng)操作規(guī)程高效液相色譜儀(Agilent 1100)操作注意事項色譜掃盲班Agilent1100高壓液相色譜儀基本操作步驟Agilent1100液相基本操作步驟(一)、開機：600E2487 打開計算機,進入Windows NT （或Windows 2000）畫面,并運行Bootp Server程序。 打開Purge閥。 單擊Pump圖標，出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單，單擊Pump Control選項，選中Off，單擊Ok關(guān)泵， 關(guān)閉Purge 1單擊Pump圖標，出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單，單擊Setup pump選項，進入Pump編輯畫面，設(shè)Flow：。也可輸入停泵的體積。 ●單擊Ok 進入下一畫面。 泵參數(shù)設(shè)定：（以二元泵為例） 單擊Ok進入下一畫面。 自動進樣器參數(shù)設(shè)定:“Use injector program”可以點擊Edit 鍵進行進樣程序編輯。 ●在”Wavelength”下方的空白處輸入所需的檢測波長,如254nm,點擊ok進入下一畫面。 DAD檢測器參數(shù)設(shè)定: 參比波長：一般選擇在靠近樣品信號的無吸收或低吸收區(qū)域。同時可以輸入采集光譜方式，步長，范圍，閾值。 ●點擊Ok進入下一畫面。 ●色譜條件: 光學(xué)單元溫度:2℃,設(shè)定為Off,手動purge 參比池，將其設(shè)為On，并輸入Purge 時間。 樣品：P/N 0101868704 進樣體積：5ul。 ● 30℃ ?！?● Multi Ex ： 多波長及光譜（激發(fā)）。 ● 在“ Run time checklist ”中選中“Data acquisition”，單擊Ok。 1從菜單 “View”中選中”O(jiān)nline signal” ,選中Windows 1,然后單擊Change 鈕,將所要繪圖的信號移到右邊的框中,點擊Ok.(如同時檢測二個信號,則重復(fù)12,選中Windows 2)。 1從Instrument 菜單選擇System on。從Ranges中選擇Auto scale及合適的顯示時間，單擊ok,或選擇”Use Ranges” 調(diào)整。 (1)、從“Report”菜單中選擇“Specify report”選項，進入如上畫面。(四)、關(guān)機: ●流動相使用前必須過濾，不要使用多日存放的蒸餾水（易長菌）。維護知識問答為什幺溶劑和樣品要過濾?色譜柱：由于填料顆粒很細，色譜柱內(nèi)腔很小，溶劑和樣品中的細小顆粒會使色譜柱和毛細管容易堵塞。13mm內(nèi)徑：適用于范圍廣的過濾，,材料為纖維素。醋酸纖維濾膜：不適用于有機溶劑，特別適用于水基溶液，推薦用于蛋白質(zhì)和其相關(guān)樣品。,必須使用該在線沖洗選項. 90%水+10%。為使柱外效應(yīng)減之最小，獲得理想的分析結(jié)果，Agilent 1100LC 使用加工工藝難度高的毛細管線作為流動相管路。 流動相使用前必須進行脫氣處理 ，以除去其中溶解的氣體（如O2），以防止在洗脫過程中當流動相由色譜柱流至檢測器時，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。常用的脫氣方法比較： 氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度比空氣低，連續(xù)吹氦脫氣，效果較好，但成本高。在線真空脫氣法：Agilent1100LC真空脫機利用膜滲透技術(shù)， 在線脫氣，智能控制，無需額外操作，成本低，脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。 溶劑的質(zhì)量或污染以及藻類的生長會堵塞溶劑過濾器，從而影響泵的運行，尤其水溶液或磷酸鹽緩沖液（PH=4—7）。