啤酒酵母ecm25yjl201w基因敲除對啤酒風味穩(wěn)定性的影-全文預覽
【正文】 acellular GSH content of G03/a。 ●: G03圖9 EBC發(fā)酵過程中啤酒酵母胞內(nèi)及胞外GSH含量Fig. 9 The intracellular and extracellular GSH content during EBC fermentation■: Intracellular GSH content of G03。177。Extracellular GSHof final beer3177。177。177。這可能是因為隨著發(fā)酵過程的進行, GSH延緩了自由基反應(yīng)和一些老化物質(zhì)的前驅(qū)物質(zhì)的產(chǎn)生而自身消耗了一部分。而和原菌G03相比, 轉(zhuǎn)化菌G03/a主酵后SI系數(shù)、胞外GSH含量, 成品啤酒SI系數(shù)、胞外GSH含量和RSV值都得到提高。成品啤酒中G03/% (P), % (P)。主酵后, 轉(zhuǎn)化菌G03/% (P)%。177。Apparent fermentationdegree (%)177。177。177。177。連續(xù)發(fā)酵3代。所以, 氨基酸代謝和谷胱甘肽的胞外積累有著千絲萬縷的關(guān)系。但是他沒有給出確切的理由, 只是推測谷胱甘肽的含量可能和凝集素的表達調(diào)控相關(guān)。 ■MI4敲除可以在細胞對數(shù)生長期提高GSH的分泌量, 且在主發(fā)酵溫度11oC下, GSH的分泌更為有利。 △: MI4圖7 在11oC和28oC下啤酒酵母有氧生長胞內(nèi)GSH含量Fig. 7 The intracellular GSH content of brewing yeast under different tempraturesA: propagate temperature 11oC。通過蛋氨酸連續(xù)馴養(yǎng)得到的GSH合成能力提高的MI4 (圖7), 胞外GSH含量在對數(shù)生長期卻沒有轉(zhuǎn)化菌G03/a高, 這表明, ECM25基因的圖6 在11oC和28oC下啤酒酵母有氧生長的胞外GSH含量Fig. 6 The extracellular GSH content of brewing yeast under different tempraturesA: propagate temperature 11oC。圖5 轉(zhuǎn)化菌的遺傳穩(wěn)定性Fig. 5 Genetic stability assayG03/a: after 10th generations of culture transferring. A: YPD plate with G418 (200 mg/L), B: YPD plate 轉(zhuǎn)化菌G03/a、原菌G03和MI4在11oC和28oC下有氧生長及胞內(nèi)外GSH含量由于啤酒酵母的最適生長溫度為28oC, 而主發(fā)酵過程的溫度為11oC, 故選取這兩個溫度點, 在有氧生長條件下, 比較轉(zhuǎn)化菌G03/a、原菌G03和MI4胞內(nèi)外GSH含量。圖4 轉(zhuǎn)化菌基因敲除的驗證Fig. 4 Detection of gene deletion events by PCR analysis1, 3 and 2, 4 were the results of G03 and G03/a, respectively. The primer for 1 and 2。 2: the negative control。 轉(zhuǎn)化菌的驗證及遺傳穩(wěn)定性轉(zhuǎn)化子DNA水平上的鑒定先采用PCR來驗證。圖1 SFHPCR構(gòu)建破壞盒Fig. 1 PCRSynthesis of disruption cassettes with small flanking homology (SFHPCR)M: marker (lDNA/EcoR I+Hind III)。序列分析表明, G03 ECM25的核苷酸序列與S. cerevisiae Z49476和AY692747 (Baker’s yeast)的ECM25的同源性為99%。待4個樣品全部陳化好后, , 以對照為空白, 530 nm下測定不同陳化時間下樣品的吸光度, 即為ΔTBAt值。 溫度室溫。 微波功率4 mW。 電子自旋共振(ESR)法測定啤酒(發(fā)酵液)中的自由基 mL除氣啤酒(發(fā)酵液)裝入離心管, 外覆鋁箔避光, 加入PBN溶液10 mL, mol/L, 混勻。 分光法測定DPPH清除率DPPH溶液配制: 準確稱取20 mg DPPH, 用無水乙醇溶解并定容至250 mL。 酵母胞內(nèi)GSH含量先將酵母細胞用蒸餾水洗滌2次后置于20oC冷凍后煮沸15 min, 然后在濃度為40%(V/V)的乙醇溶液中30oC下振蕩抽提2 h, 測定上清液GSH濃度, 除以相應(yīng)細胞干重得到胞內(nèi)GSH含量。 低溫發(fā)酵(1) 錐形瓶發(fā)酵: 斜面菌種經(jīng)擴培, 接種于含有300 mL麥汁的錐形瓶中, 于11oC低溫培養(yǎng)箱中進行主發(fā)酵, 發(fā)酵6 d后, 主發(fā)酵結(jié)束, 取部分發(fā)酵液過濾測定各項理化指標及老化指標, 其余裝瓶4oC后發(fā)酵10 d, 進行感觀品評并測定RSV值。 4oC保溫。在含G418終濃度為200 mg/L的YPD平板上涂布篩選轉(zhuǎn)化子, 培養(yǎng)5~7 d后, 將長出的酵母在G418平板上再劃線一次, 得到單菌落。 4oC保溫。 若為篩選培養(yǎng)基, 加入G418, 使其在培養(yǎng)基中的終濃度為200 mg/L。其他生化試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。pUG6為本實驗室保存。本次研究主要是對一株工業(yè)啤酒酵母(Saccharomyces carlsbergensis)G03通過同源重組, 以卡那抗性基因替換, 敲除ECM25基因, 獲得了一株GSH分泌量增加的抗老化啤酒酵母菌株G03/a。此外, GSH也能防止釀造酒色澤改變和香氣損失并有抑菌的作用[3]。關(guān)鍵詞: 啤酒酵母, 基因敲除, ECM25, 谷胱甘肽, 分泌, 啤酒風味穩(wěn)定性Effects of Knockout ECM25/YJL201W Gene in Brewing Yeast on Beer Flavor StabilityYixin Zhang, Qi Li, Wei Shen, Yan Xie, and Guoxian GuThe Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, ChinaAbstract: The ECM25 deletion mutant of industrial brewing yeast, G03/a, was constructed by replacing the ECM25 gene with the kanMX gene. The transformant was verified to be genetically stable. The PCR analysis showed that ECM25 gene in the G03/a was deleted. Under aerobic conditions of 11oC and 28oC, pared with the host strain G03, the excretive glutathione concentration of G
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