大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)問(wèn)題及對(duì)策-全文預(yù)覽
【正文】 的介質(zhì)如Superose、Sephacryl HR依據(jù)分子量將 樣品分成不同組份。純化前首先需要測(cè)定生物分子的各物理和化學(xué)特性，然后通過(guò)實(shí)驗(yàn)選擇出最有效的純化流程?！? 灌注培養(yǎng)發(fā)展到現(xiàn)在, 還有許多急待解決的問(wèn)題。在細(xì)胞生長(zhǎng)期, 提供充分的營(yíng)養(yǎng), 供細(xì)胞的需要。3. 3 控制葡萄糖和谷氨酰胺法在細(xì)胞中, 葡萄糖代謝和谷氨酰胺代謝密切相關(guān)。氨對(duì)細(xì)胞的毒性比乳酸大得多, 表現(xiàn)為降低比生長(zhǎng)速率, 增加死亡速率。由于葡萄糖的價(jià)格相對(duì)低廉, 這種方法很有前途。 在產(chǎn)物合成期降低葡萄糖的濃度, 降低乳酸的產(chǎn)生速率, 避免乳酸的積累, 減少毒害, 降低死亡速率, 維護(hù)持活細(xì)胞數(shù)在較高水平。具體有以下方法。但是, 一方面由于灌注培養(yǎng)細(xì)胞濃度很高, 提高灌注速率, 營(yíng)養(yǎng)成分的供給十分充分, 氨和乳酸的產(chǎn)生速率也增加了。在細(xì)胞生長(zhǎng)期有的細(xì)胞可能會(huì)因比生長(zhǎng)速率過(guò)大而產(chǎn)生非生產(chǎn)性細(xì)胞, 這時(shí)就應(yīng)控制比生長(zhǎng)速率在一個(gè)適當(dāng)?shù)姆秶?。然? 在細(xì)胞培養(yǎng)中, 細(xì)胞生理狀態(tài)的檢測(cè)很麻煩。溶氧過(guò)低, 細(xì)胞過(guò)氧的需求得不到滿(mǎn)足, 依然會(huì)降低產(chǎn)物蛋白的產(chǎn)率。通常在細(xì)胞生長(zhǎng)初期控制溶氧的較低的水平, 在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期, 當(dāng)細(xì)胞達(dá)到較高的濃度時(shí), 提高溶氧水平。有人把CO 2 的濃度由5% 降為2. 5% ,胞內(nèi)pH 提高了0. 2 個(gè)單位。近年來(lái), 對(duì)胞內(nèi)pH 的研究比較活躍。當(dāng)產(chǎn)物蛋白對(duì)細(xì)胞有抑制時(shí), 階段培養(yǎng)尤見(jiàn)優(yōu)勢(shì)。2. 1 階段培養(yǎng)一般認(rèn)為, 動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件應(yīng)盡量模擬來(lái)源動(dòng)物體內(nèi)的條件, 而且在培養(yǎng)中通常保持不變。階段法培養(yǎng)就是根據(jù)這一點(diǎn), 把培養(yǎng)過(guò)程分為細(xì)胞生長(zhǎng)期和產(chǎn)物生成期, 分別采取不同的培養(yǎng)條件, 以達(dá)到在細(xì)胞生長(zhǎng)期使接種細(xì)胞大量繁殖, 提高比生長(zhǎng)速率, 盡快獲得高密度細(xì)胞。 灌注培養(yǎng)可以從兩個(gè)方面入手, 一是改變動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境, 實(shí)行階段培養(yǎng)。懸浮灌注培養(yǎng)是在普通懸浮培養(yǎng)的基礎(chǔ)上, 加上一個(gè)細(xì)胞分離器而成, 以微載體懸浮培養(yǎng)加旋轉(zhuǎn)過(guò)濾分離器最為常見(jiàn)。在灌注培養(yǎng)中, 細(xì)胞保留在反應(yīng)器系統(tǒng)中, 收獲培養(yǎng)液的同時(shí)不斷地加入新鮮的培養(yǎng)基。如何完善細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù), 提高動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的產(chǎn)率, 一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。改善細(xì)胞環(huán)境是當(dāng)前眾多 生物反應(yīng)器及控制器研究者的不懈努力方向。5 結(jié)論與展望可以推斷，更多的代謝中間產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)微影響和機(jī)理將逐漸得以充分認(rèn)識(shí)。細(xì)胞呼吸商似乎是衡量細(xì)胞生理狀態(tài)的潛在的有用參數(shù)，可測(cè)定在線氧吸收速率并用質(zhì)譜儀分析廢氣中二氧化碳呼出率計(jì)算 呼吸商。在生物反應(yīng)器中，溫度、pH值、溶解氧濃度是細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模放大的早期研究?jī)?nèi)容。構(gòu)建細(xì)胞系時(shí)，細(xì)胞周 期特異表達(dá)調(diào)控具有重要研究和應(yīng)用意義。另外，控制外源基因表達(dá)的啟動(dòng)子的特性是基因表達(dá)的基礎(chǔ)之一。tPA表達(dá)水平及分泌效率均和它與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的結(jié)合蛋白(BiP)這種分子伴侶的結(jié)合程度負(fù)相關(guān)。有些細(xì)胞株依賴(lài)于血清源性生長(zhǎng)因子的特性可通過(guò)分子遺傳途徑予以改變，即導(dǎo)入特異生長(zhǎng)因子的基因，使細(xì)胞能合成自身的生長(zhǎng)因子來(lái)滿(mǎn)足細(xì)胞生長(zhǎng)需要，而對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)副作用。在生產(chǎn)疫苗、單抗和各種生物活性蛋白等生 物制品的應(yīng)用領(lǐng)域中，優(yōu)化無(wú)血清培養(yǎng)基的成分可使不同的細(xì)胞在最有利于細(xì)胞生長(zhǎng)和表達(dá)目的產(chǎn)物的環(huán)境中維持高密度培養(yǎng)。其優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)品成本降低，產(chǎn)量提高，遺傳一致性高。因此，需要尋求在低表達(dá)水平便可達(dá)到目的的更強(qiáng)的細(xì)胞凋亡抑制基因。隨著細(xì)胞凋亡分子機(jī)制研究的不斷深入，細(xì)胞凋亡的發(fā)生被認(rèn)為是大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的重要制約環(huán)節(jié)，預(yù)防并控制細(xì)胞凋亡也 因此成為研究熱點(diǎn)。為創(chuàng)造更大優(yōu)勢(shì)，多孔微載體內(nèi)部保護(hù)空間必須保證細(xì)胞能夠進(jìn)入生長(zhǎng)。由于細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境不斷變化，有關(guān)滲透壓影響的量化進(jìn)展不大。另外，培養(yǎng)基中 加入胎牛血清可降低MG濃度。增加培養(yǎng)基中谷氨酰胺濃度也會(huì)引起MG中度增加。甲 基乙二醛(MG)主要是丙糖磷酸去除磷酸基后的代謝產(chǎn)物，也是脂類(lèi)、氨基酸代謝的產(chǎn)物，對(duì)于細(xì)胞有潛在的損傷作用。常規(guī)/高滲透壓條件下，高CO2分壓使重組CHO細(xì)胞系的生長(zhǎng)和組織型纖溶酶原激活劑(tPA)產(chǎn)率均受到抑制。隨 著細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模和培養(yǎng)密度的增大，由于二氧化碳的產(chǎn)生速率比通過(guò)換氣從培養(yǎng)基中去除二氧化碳快因而導(dǎo)致CO2積聚，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用或者改變細(xì)胞代 謝水平。由于糖酵解和Gln的分解速度降 低，能量產(chǎn)生減少，更多的能量用于維持離子濃度梯度，因此高乳酸濃度必將抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。高濃度乳酸會(huì)抑制乳酸脫氫酶(LDH），從而減少乳酸產(chǎn)生。Asp消耗增加可能會(huì)從Gln代謝多經(jīng)天冬氨 酸轉(zhuǎn)氨酶途徑而不是丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶或谷氨酸脫氫酶途徑得以補(bǔ)償。體外動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中氨離子的積累是抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的主要因素之一。大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的問(wèn)題及對(duì)策大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的問(wèn)題及對(duì)策動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)開(kāi)始于本世紀(jì)初，到1962年規(guī)模開(kāi)始擴(kuò)大，發(fā)展至今已成為生物、醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用中廣泛采用的技術(shù)方法，利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價(jià)值 的酶、生長(zhǎng)因子、疫苗和單抗等，已成為醫(yī)藥生物高技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要部分。細(xì) 胞培養(yǎng)環(huán)境中抑制因素的積聚是提高細(xì)胞密度的主要限制因素。細(xì) 胞消耗Asp增加，可能是細(xì)胞線粒體膜上蘋(píng)果酸－天冬氨酸泵轉(zhuǎn)運(yùn)NADH加快，使細(xì)胞維持糖酵解途徑的需要。乳 酸是細(xì)胞糖代謝的產(chǎn)物。乳酸抑制糖酵解也導(dǎo)致低濃度丙酮酸，從而導(dǎo)致Gln消耗減少。這些 代謝改變機(jī)理的研究將有利于設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)目刂品桨?。在一定的pH條件下，CO2分壓升高會(huì)使 培養(yǎng)基滲透壓升高。盡管如此，控制通氣參數(shù)，平衡氧的輸 送及CO2的去除，防止生物反應(yīng)器運(yùn)轉(zhuǎn)中CO2積聚仍是明智選擇。葡萄糖濃度很高(100mM)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)MG幾乎是正常培養(yǎng)條 件下的兩倍。通過(guò)批次培養(yǎng)中限制葡萄糖用量來(lái)降低葡萄糖消 耗，由此來(lái)確定降低糖酵解代謝是否導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)MG濃度降低，從而最終確定MG濃度降低是否提高培養(yǎng)活力或影響產(chǎn)品特性的研究具有重要意義。高滲透壓不僅影響細(xì)胞批次 培養(yǎng)中抗體或tPA產(chǎn)量，而且影響細(xì)胞生長(zhǎng)速度、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的長(zhǎng)短、細(xì)胞死亡的速度。多孔微載體的研制替代了容易使細(xì)胞受機(jī)械攪拌與噴氣損傷的常規(guī)載體。最初的研究似乎表明細(xì)胞死亡大多由于壞死，而人們逐漸認(rèn)識(shí)到至少是一些細(xì)胞系在生物反應(yīng) 器中細(xì)胞死亡主要原因是細(xì)胞凋亡。對(duì)細(xì)胞的這種保護(hù)作用依賴(lài)于bcl2等抑制基因的高水平 表達(dá)。方法是向CHO細(xì)胞中導(dǎo)入p2p27的基因，使細(xì)胞周期中G1期延長(zhǎng)(細(xì)胞靜止)，改造后，細(xì)胞活力正常，外 源基因表達(dá)蛋白量提高。無(wú)血 清培養(yǎng)基的優(yōu)勢(shì)在于避免了血清的批次、質(zhì)量、成分等對(duì)細(xì)胞培
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