《酯酶與氧化酶》ppt課件-全文預(yù)覽
【正文】 F A D + R C H 2 N H 2 + H 2 O E F A D H 2 + R C H O +E F A D H 2 + O 2 E F A D + H 2 O 2N H 3反應(yīng)產(chǎn)物有醛和 H2O2，利用醛的還原性和 H2O2的氧化性進行組化染色。 四、單胺氧化酶 (Monoamine Oxidase, MAO) 又稱腎上腺素氧化酶，酪胺酶。 (5) 流水沖洗； (6) Bouin液固定 24h。 孵育液 ，溶于 酸緩沖液中， 。是研究代謝旺盛細胞線粒體的有效手段。 DAB將氧化型細胞色素Ｃ還原，還原型細胞色素Ｃ又被細胞色素 a再氧化，反復(fù)循環(huán)進行，DAB不斷被氧化，反應(yīng)氧化物沉淀沉積。 （ 4）結(jié)果 酶活性部位呈 茶褐色 沉淀，細胞內(nèi)線粒體數(shù)目多者酶活性強。 2. 二氨基聯(lián)苯胺法 （ DAB法 , diaminobenzidine） 原理 細胞色素氧化酶（ CCO）能催化 DAB，被 H2O2氧化，在新鮮或固定標(biāo)本上生成 棕色沉淀。 H3C C H3NN H2+O H細胞色素氧化酶NC H3H3CNO+ H2O2二甲基對苯二氨靛酚藍萘酚（一）顯示方法 Nadi氧化酶反應(yīng)（ Naphtholdiamine, 萘酚二胺） （ 1）反應(yīng)原理 O2 （ 2）孵育液 N苯基 對苯二胺 （底物） 3mg 1羥基 2萘酚 3mg 二甲基亞砜 混勻，過濾。 N A D H F M N ( F e S) C oQ C y t b C y t c1C y t c C y t a a 3 O2 H 2 O[ ] [ ]N A D H C oQ 還原酶 C oQC y t C 還原酶細胞色素氧化酶電子傳遞鏈二、細胞色素氧化酶 (Cytochrome Oxidase, CCO) 細胞色素 (Cytochrome, cyt)是生物細胞內(nèi)一類傳遞蛋白質(zhì)，含有鐵呋啉輔基，具有紅色而取名細胞色素。脫下的氫大多由NAD+、 NADP+、 FAD接受， NAD+、 FAD是常見 脫氫酶 的輔酶或輔基。 氧化劑： 受電子體（或受氫體 )Fe3+(高鐵離子）。 催化上述反應(yīng)的酶，稱 氧化還原酶 。 胰腺 最為豐富，其次是 肝臟、腎臟、脾臟 、唾液腺導(dǎo)管 （但大鼠極少）、胃賁門、睪丸基質(zhì)細胞中也存在。孵化時間過長，易彌散。 （一）顯示方法 —— 硫化鉛法（吐溫法之一， Gomori,1954) １、基本原理 以長鏈脂肪酸酯為底物，在脂酶作用下，分離出的脂肪酸可與鈣形成鈣皂沉淀，再用鉛置換鈣，最后經(jīng)硫化胺置換生成棕黑色硫化鉛沉淀。是了解膽堿能神經(jīng)元及其所支配器官的重要指標(biāo)。 操作步驟 （ 1） 固定： 8μm厚的冰凍切片在 10%蔗糖和 2%戊二醛的 25mmol/LHEPES緩沖液 （ ） 中固定5min； （ 2 ） 漂洗： 用含 10% 蔗糖的 HEPES 緩沖液洗15min 3； （ 3） 孵育： 切片入孵育液中 ， 室溫 ， 3h； （ 30℃ ，1530min） ； （ 4） 蒸餾水洗 3次； （ 5） 1%硫化銨顯色 2min； （ 6）緩沖液漂洗，甘油明膠封固。膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的強弱是膽堿能神經(jīng)生理功能的標(biāo)志，因此將 ChAC確認為膽堿能神經(jīng)的標(biāo)志酶。用 RTPCR方法證明了凋亡細胞有 AChEmRNA的轉(zhuǎn)錄。 AChE是 生物神經(jīng)傳導(dǎo) 中的一種關(guān)鍵性的酶，在膽堿能突觸間，該酶降解乙酰膽堿，終止神經(jīng)遞質(zhì)對突觸后膜的興奮作用，保證神經(jīng)信號在生物體內(nèi)的正常傳遞。 Cu2+濃度太小易彌散， ，高于６易擴散。 乙酰膽堿鹽 AChE 硫代膽堿 若用 四異丙基焦磷酰胺 抑制膽堿酯酶，可單獨顯示乙酰膽堿酯酶。 （二）非特異性酯酶的生物學(xué)意義 特異性酯酶 脂酶 乙酰膽堿酯酶 膽堿酯酶 底物 高級脂肪 酸 乙酰膽堿， 乙酰 β基甲基膽堿 乙酰膽堿， 苯甲酰膽堿， 長鏈脂肪酸膽堿 抑制劑 毒扁豆堿 異丙基 氨基焦酰胺 (ISOOMPA) 四異丙基 氨基焦酰胺 激活劑 %?；悄懰徕c 廣義的 膽堿酯酶 包括 乙酰膽堿酯酶（ AChE)和狹義的 膽堿酯酶 (ChE)，兩者化學(xué)性質(zhì)不同，用酯來檢測底物特異性時， 乙酰膽堿酯酶 能最快地促使 乙酰膽堿分解 ，也能水解乙酰 β基甲基膽堿，但不能水解苯甲酰膽堿，此酶能被 高濃度的乙酰膽堿抑制 。 因此酶活性與顯色無平行關(guān)系， 可定性不可定量。 4. 結(jié)果 酶活性處呈紅棕色 腹水癌細胞中的酯酶 巨噬細胞中的酯酶 (靛藍法 ) Pearse, 1972 １ .原理 醋酸吲哚酚經(jīng)酶水解釋放出吲哚酚，再氧化形成靛藍沉著于酶所在部位。 4℃ 固定 1618小時，時間隨酶活性強弱不同。活性部位的染色視重氮鹽不同而異。 ?萘酚系統(tǒng) 可用重氮鹽堅牢藍Ｂ，堅牢藍 RR，堅牢紅 RC鹽。根據(jù) E600, DFP, PCMB對它們的抑制作用不同，分為 3類 . 1. 芳香 \基酯酶 (Aromesterase)，即 A酯酶，亦稱有機磷酸抵抗性酯酶 I。通常根據(jù)對底物是否具有特異性，可分為 特異性 與 非特異性酯酶 兩種。通式 RCOOR`，結(jié)構(gòu)上可看作羧酸中的羥基被 烴氧基（ OR`） 取代的產(chǎn)物，亦可看作醇中羥基的氫原子被 ?；?RCO） 取代的產(chǎn)物。 羧酸酯水解酶 (Carboxylic ester hydrolase)，是所有能催化羧酸酯水解的酶的總稱（或稱酯酶），其作用是水解脂肪族酯和芳香族酯，催化的反應(yīng)式： R C O O R,+ H 2 O R C O O H + R,O H水解酶酯化酯 脂肪酸 醇羧酸 2. 酯和酯鍵 酯由來自 羧酸的?；?和來自 醇的烴氧基 組成，是羧酸與醇反應(yīng) 失水 而生成，即羧基上羥基和醇羥基上的氫共同脫水。 COO R 1酯鍵酰基 烴氧基RA R COO A R 1酯鍵?；?烴氧基 3. 酯酶與水解反應(yīng) 羧酸酯酶 水解 羧酸酯 為 醇 和 羧酸 芳香酯酶 水解 乙酸苯酯 為 酚 和 乙酸
環(huán)評公示相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1