【正文】 狀噬菌體（ M1 f1等）外殼顆粒的一端，有 35個(gè)基因 Ⅲ 編碼的蛋白質(zhì)（ g3p），在識(shí)別和吸附大腸桿菌的過(guò)程中起作用。 ② 特點(diǎn) PCR產(chǎn)物往往在 3’端突出一個(gè) A，所以能與這個(gè)載體直接連接。 3）選擇方便 有 Ampr和 lacZ’，可以進(jìn)行 Amp抗性選擇和 XgalIPTG藍(lán)白斑選擇。 由 pUC質(zhì)粒載體、 f1噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)和T T7噬菌體的啟動(dòng)子 組成。 2）單鏈滾環(huán)噬菌體復(fù)制模式 外殼蛋白 復(fù)制蛋白 輔助 M13 包裝 當(dāng)寄主細(xì)胞被 輔助噬菌體 M13感染后。 118 （ 3） pUC118/pUC119 ① 構(gòu)成 1） M13的基因間隔區(qū)（ IG） 2） pUC18/pUC19質(zhì)粒載體： 帶有 M13復(fù)制起點(diǎn)。 MCS 噬菌體 ori 質(zhì)粒 ori Ampr lacZ’ lacI 116 約 3000bp（比 M13?。? ② 克隆能力大 能插入 10kb的外源 DNA。 M13mp M13mp M13mpM13mp M13mp1 M13mp1M13mp19 對(duì)應(yīng)有相同 MCS的 pUC系列載體： pUC pUC pUC pUCpUC1 pUC1 pUC19 成為 M13mp系列載體： 108 109 與 pUC18相同 M13mp18的多克隆位點(diǎn) 110 4. M13系列載體的優(yōu)點(diǎn) （ 1）有 MCS，便于克隆不同的酶切片段 （ 2） Xgal顯色反應(yīng)，可供直接選擇 （ 3）無(wú)包裝限制，克隆能力大 （ 4）可以克隆雙鏈 DNA分子中的每一條鏈 子代 M13噬菌體中包含的是單連 +DNA。 （ 2）加入酶切位點(diǎn) ① 在 IG區(qū)內(nèi)加入單一內(nèi)切酶位點(diǎn) 第一個(gè) M13載體： M13mp1： 104 M13 RF BsuI不完全消化 各種長(zhǎng)度的線(xiàn)性片斷 （其中應(yīng)有只在IG上切開(kāi)的線(xiàn)性全長(zhǎng) M13） lac基因的HindII片斷 (lacI、lacP、 lacO、 lacZ’） 連接 M13mp1 JM101宿主 只有在 IG區(qū)插入 lacZ’才能存活并在 Xgal上出現(xiàn)互補(bǔ)的藍(lán)噬菌斑 105 （ 3） M13載體系列 加上常用的酶切位點(diǎn)。 其余 9個(gè) BsuI限制性位點(diǎn)分布在其它部位。 但 M13 DNA可以轉(zhuǎn)染雌性大腸桿菌。（ ssDNA） （ 4）不存在包裝限制。 1. 單鏈 DNA噬菌體的特點(diǎn) （ 3） RF DNA和 ssDNA都能轉(zhuǎn)染感受態(tài) 大腸桿菌。 整合到細(xì)菌染色體的 噬菌體 DNA稱(chēng)為 原噬菌體 ，隨細(xì)菌的染色體復(fù)制而復(fù)制。 除了對(duì)寄主的依賴(lài)性，還具備其它的功能： 保護(hù)自己的核苷酸分子（ DNA、 RNA）免遭環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的破壞； 將其核苷酸分子注入到被感染的細(xì)菌細(xì)胞； 將被感染的細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)變成制造噬菌體的體系，從而長(zhǎng)生出大量的子代噬菌體顆粒； 使感染的細(xì)菌細(xì)胞釋放出子代的噬菌體顆粒 87 噬菌體的結(jié)構(gòu)和其核酸類(lèi)型 ： 結(jié)構(gòu)： 無(wú)尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型、 具尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型、 線(xiàn)狀體型 核酸類(lèi)型：最常見(jiàn)的是雙鏈線(xiàn)性 DNA、 雙鏈環(huán)形 DNA、 單鏈環(huán)形 DNA、 單鏈線(xiàn)形 DNA、 單鏈 RNA。 二聚體質(zhì)粒的復(fù)制速度是單體的二倍！導(dǎo)致質(zhì)粒失控。 差度（ variance）： 是產(chǎn)生無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞的重要原因。 IS dimer 重組 79 （ 1）新陳代謝負(fù)荷： 5. 影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素 使寄主細(xì)胞生長(zhǎng)減緩： 質(zhì)粒載體使寄主的世代時(shí)間延長(zhǎng)約 15%。 人工質(zhì)粒。 75 有主動(dòng)分配和隨機(jī)分配兩種假說(shuō)。 （ 1） pGEM3Z的特點(diǎn)： 69 3. 穿梭質(zhì)粒載體 （ 1）穿梭質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu) 人工構(gòu)建的、具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記、可以在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。 T7啟動(dòng)子 SP6啟動(dòng)子 MCS lacZ’ Ampr ori 可被 T7和 SP6的 RNA聚合酶識(shí)別轉(zhuǎn)錄。 ③ 克隆便利 具有多克隆位點(diǎn)（ MCS），使有兩個(gè)不同粘性末端的外源 DNA方便地插入。 IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果： 63 無(wú)質(zhì)粒的 受體菌 ?半乳糖苷酶部分缺失，不能分解 Xgal；無(wú)抗菌素抗性 在含抗菌素和 Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng) 無(wú)菌斑生長(zhǎng) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體菌 ?半乳糖苷酶的缺失被載體產(chǎn)物?互補(bǔ)，能分解Xgal。從而互補(bǔ)。 C端大部分 N端的 1141aa pUC lacZ’ 受體菌 lacZ? 3）載體 lacZ’與 ?互補(bǔ) 60 4） ?互補(bǔ)的插入失活 pUC載體上 LacZ’的 5’端有一段多克隆位點(diǎn) (MCS)區(qū)，本身雖不干擾 LacZ’的合成，但插入外源基因就會(huì)阻止 LacZ’的合成。 X－ gal 半乳糖 5溴 4氯靛藍(lán) ?半乳糖苷酶 ② ?半乳糖苷酶 Xgal顯色反應(yīng)： 57 ③ lacZ的 ?肽互補(bǔ) 1） ?肽（ lacZ’ ）： ?半乳糖苷酶 N端的一段氨基酸片斷（1141氨基酸）。 ② Ampr 基因 （ 1）元件來(lái)源 ③ lacZ的啟動(dòng)子 大腸桿菌 ④ lacZ’基因 大腸桿菌 lacZ的 ?肽鏈序列， 是 LacZ 的氨基端片斷。 cmlr上也帶一個(gè) EcoRI位點(diǎn) 。 47 保留了轉(zhuǎn)移蛋白（ mob）的 作用位點(diǎn) 。 45 外源基因 ?BamH I Amp中存活 但在 Tet中死亡 外源基因 ?Pst I Tet中存活 但在 Amp中死亡 46 氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個(gè)細(xì)胞可達(dá)1000~3000copy ④ 安全 失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因 mob（ mobilization）。 （ 4）克隆位點(diǎn) 其中 9個(gè)會(huì)導(dǎo)致 Tetr基因失活（如BamH I、 Hind Ⅲ 、 Sal I）； 3個(gè)會(huì)導(dǎo)致 Ampr基因失活（ Sca I、PvuI、 Pst I）。 38 復(fù)制起始點(diǎn) ORI、 選擇標(biāo)記、 多克隆位點(diǎn) MCS 2）大腸桿菌操縱子元件 阻遏基因 I 操縱基因 O 啟動(dòng)基因 P 核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（ SD） 轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)區(qū)。 目前通用的絕大部分質(zhì)粒載體都是正選擇載體。 如 pDF4 pDF4 pBR329。 溫度低（低于 37 oC），拷貝數(shù)很少； 溫度增加（ 40 oC）時(shí)，拷貝數(shù)會(huì)很快增加到 1000個(gè)以上。 33 （ 2）低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體 但有特殊用途 : 由 pSC101派生來(lái)的載體特點(diǎn)是分子量小，拷貝數(shù)低。 不帶有 抗菌素抗性基因 的受體菌不能在含有抗菌素的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）中生長(zhǎng)。 29 v）四環(huán)素（ Tetracycline， Tet） b）細(xì)菌抗性原理 a）抑菌原理 通過(guò)與 30S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。 b）細(xì)菌抗性原理 Kanr 編碼的 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 ，對(duì)卡那霉素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體結(jié)合作用。殺死 生長(zhǎng)的細(xì)菌 。 24 A typical plasmid vector. It contains a polylinker which can recognize several different restriction enzymes, an ampicillinresistance gene (ampr) for selective amplification, and a replication origin (ORI) for proliferation in the host cell. 25 常用抗菌素的抗性工作原理 i）氨芐青霉素（ Ampicillin， Amp） 青霉素的衍生物。理想的載體應(yīng)該有兩種抗菌素抗性基因。 （接合型質(zhì)粒分子量大，一般屬?lài)?yán)緊型）。 （ 2） Col質(zhì)粒： 大腸桿菌素對(duì)不帶 Col質(zhì)粒的大腸桿菌有毒。 14 大腸桿菌接合（ conjunction） 15 2. 非接合型質(zhì)粒： 雖然帶有自我 復(fù)制 所必需的遺傳信息，但失去了控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合 轉(zhuǎn)移 的基因，因此不能從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。 SC OC L 11 L OC SC 12 二、質(zhì)粒的類(lèi)型 在大腸桿菌中的質(zhì)粒，可以分為： 接合型質(zhì)粒 : 非接合型質(zhì)粒 能自我轉(zhuǎn)移 不能自我轉(zhuǎn)移 13 除了帶有自我 復(fù)制 所必需的遺傳信息外還帶有一套控制細(xì)菌 配對(duì) 和質(zhì)粒 接合轉(zhuǎn)移 的基因。 （酵母的“殺傷質(zhì)?！笔?RNA）。 細(xì)菌人工染色體 。 便于外源 DNA插入載體而不影響載體的復(fù)制。第二章 基因工程 的載體 1 載體 ? 在基因工程操作中，把能攜帶外源 DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的 DNA分子叫 載體（ vector）。 ? （ 3）有一段多克隆位點(diǎn)。 3 載體的種類(lèi) 按照來(lái)源分為： 按照功能分為： ? 質(zhì)粒（ plasmid） ? 單鏈 DNA噬菌體 M13 ? ?噬菌體的衍生物 ? 柯斯質(zhì)粒（ cosmid） ? 動(dòng)物病毒（ virus） ? 克隆載體 : 克隆一個(gè)基因或 DNA片斷 ? 表達(dá)載體 : 用于一個(gè)基因編碼的蛋白表達(dá) ? 整合載體 : 把一個(gè)基因插入到染色體組中 4 載體的分類(lèi) 分類(lèi)依據(jù) 類(lèi) 別 舉 例 （ 1） 克隆載體 （ 2） 表達(dá)載體 pBR322 pCDN3 （ 1） 原核載體 （ 2） 真核載體 （ 3） 穿梭載體 pUC18 pBUDCE41 YEC 質(zhì)粒 （ plasmid） 單鏈 DNA噬菌體 M13 λ 噬菌體的衍生物 柯斯質(zhì)粒 （ cosmid） 動(dòng)物病毒 （ virus） （克隆能力）分 (1)1kb (2)10kb (3)22kb (4)50kb (5) (6) (1)M13 (2)plasmid (3)λ phage (4)casmid (5)BAC (6)YAC 5 說(shuō)明： （ shuttle vector） 指能在兩種宿主生物體內(nèi)復(fù)制的載體分子 ， 因而可以運(yùn)載目 的 基 因 穿 梭 往 返 兩 種 生 物 之 間 ， 如：YEP,DIDB219 Yeast Artificial Chromsome 由酵母基因和 pBR322質(zhì)粒衍生物構(gòu)成 ， 對(duì)克隆大的真核基因十分有用 ， 在 HGP中發(fā)揮主要作用 。 （ 3）環(huán)形狀： 雙鏈環(huán)狀 DNA。 ② 開(kāi)環(huán) DNA（ open circular， ocDNA） 10 （ 5）質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率 同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同： scDNA最快、 l DNA次之、 ocDNA最慢。 1. 接合型質(zhì)粒： 不符合基因工程的安全要求。 16 17 帶有控制 大腸桿菌素（ colicin） 合成的基因。 2. 松弛型質(zhì)粒（ relaxed plasmid） 拷貝數(shù)多 ，有 20份以上的拷貝。 目前實(shí)驗(yàn)室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個(gè)野生型質(zhì)粒構(gòu)建的： pSC101 9 kb 拷貝數(shù) 5 四環(huán)素抗性標(biāo)記基因 Tcr ColE1 kb 拷貝數(shù) 20 30 大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因