《基因組學(xué)概述》ppt課件-全文預(yù)覽
【正文】 成人類和其它重要模式生物全部基因組 DNA序列測定 ， 因此 HGP屬于結(jié)構(gòu)基因組學(xué)范疇 。 基 因 組 學(xué) Genomics 基因 合成有功能的蛋白質(zhì)或 RNA所必需的全部DNA序列 ， 即一個基因不僅包括編碼蛋白質(zhì)或RNA的核酸序列 ， 還應(yīng)包括為保證轉(zhuǎn)錄所必需的調(diào)控序列 。 ? 德國人則測定了肺炎支原體 (Mycoplasma pneumoniae)基因組全序列。首先要用多個不同的軟件來要找到并估測基因組中的每一個 ORF。無論是 GC富含區(qū)還是 AT富含區(qū)，都可能是一些特殊功能的區(qū)域。繪制出這些重疊片段的圖譜，并對重疊片段進(jìn)行測序，通過“ 拼裝 ” 得到基因組序列。首先用稀有內(nèi)切酶把待測基因組降解為數(shù)百 kb以上的片段，再分別測序。他們建立了插入片段為 1520kb的 λ文庫以備缺口填補。 ?第三，序列集合。 兩種操作方式： 1. 將不同的寡核苷酸與固定在濾膜上的靶 DNA序列樣品進(jìn)行雜交 2. 應(yīng)用寡核苷酸矩陣芯片的 DNA雜交測序法 全基因組鳥槍法測序的主要步驟 ?第一，建立高度隨機(jī)、插入片段大小為 2kb左右的基因組文庫。 ? T+C反應(yīng)：肼（低鹽） ? C反應(yīng)：肼（高鹽） 測定 DNA長度 ~250bp。 ? 哌啶：從修飾甲基處斷裂核苷酸鏈。 ? Trace diagrams are analyzed by base calling programs that use dynamic programming to match predicted and occurring peak intensity and peak location. ? Base calling programs predict nucleotide locations in sequencing reads where data anomalies occur. Such as multiple peaks at one nucleotide location, spread out peaks, low intensity peaks. MaxamGilbert法 用化學(xué)試劑處理末端放射性標(biāo)記的 DNA片斷，造成堿基的特異性切割。 Dideoxynucleotides （雙脫氧核苷酸） ? ddNTPs 是反應(yīng)終止劑 可以當(dāng)作正常堿基參與復(fù)制， 一旦鏈入 DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接。 完整基因組的測序過程一般包括三個步驟： （ 1）建立克隆的物理圖譜：如酵母人工染色體 YAC（ Yeast Artificial Chromosome）克隆、細(xì)菌人工染色體 BAC（ Bacterial Artificial Chromosome）克隆等； （ 2）測定每個克隆的序列； （ 3）序列拼裝和注釋：當(dāng)?shù)玫揭欢?DNA序列之后，可以利用序列分析工具，進(jìn)行序列的拼接；繼而通過與數(shù)據(jù)庫序列的比較，得到與該序列相關(guān)的信息，如基因、調(diào)控元件、重復(fù)區(qū)域等，進(jìn)而對序列的生物學(xué)特性進(jìn)行注釋。依片段 DNA克隆在染色體上所在的位置排序，可以得到相互重疊的一系列克隆，叫做“克隆重疊群” (contig)。 DNA序列片段組裝 （ sequence assembly)， 又稱序列拼接 ） 的任務(wù)就是根據(jù)這些序列片段 ， 重建目標(biāo) DNA序列 。 這些序列片段覆蓋待測序列 ， 并且序列片段之間也存在著相互覆蓋或者重疊 。 有人把人類染色體端粒 DNA上單個 α衛(wèi)星 DNA單元多聚化形成 1Mb左右的大片段并與人類基因組 DNA混合，產(chǎn)生了能被復(fù)制、能正常分裂并得到長期穩(wěn)定保存的人工合成的染色體，長度約為 610Mb，稱為MAC或 HAC。 以細(xì)菌寄主系統(tǒng)為基礎(chǔ)的克隆載體形成嵌合體的頻率較低，轉(zhuǎn)化效率高，又易于分離。 載體的分類 分類依據(jù) 類 別 克隆擴(kuò)增或表達(dá) 舉 例 （ 1） 克隆載體 （ 2） 表達(dá)載體 √ √ PBR322 PCDN3 型分 （ 1） 原核載體 （ 2） 真核載體 （ 3） 穿梭載體 PUC8 PBUDCE41 YE 病毒載體＋ （克隆能力）分 (1)1kb (2)10kb (3)22kb (4)50kb (5) (6) (1)M13 (2)plasmid (3)λ phage (4)casmid (5)BAC (6)YAC √ 說明： （ sbuttle vector） 指在兩種宿主生物體內(nèi)復(fù)制的載體分子 ， 因而可以運載目的基因 （ 穿梭往返兩種生物之間 ， 如： YEP,DIDB219 Yeast Artificial Chromsome 由酵母基因和PBR322質(zhì)粒衍生物構(gòu)成 ， 對克隆大的真核基因十分有用 ， 在 HGP中發(fā)揮主要作用 。 ? 復(fù)制起點 ： DNA復(fù)制通常由起始蛋白與特定的 DNA序列相互作用開始。 ? 人工染色體含有三種必需成分：著絲粒、端粒和復(fù)制起點。即使在選擇培養(yǎng)基上，也只有 5%20%的子代細(xì)胞帶有 ARS載體。 1987年， Burke等人發(fā)現(xiàn)，僅僅帶有 ARS序列 (autonomous replicating sequence) 的載體雖然能夠被復(fù)制，但極易在有絲分裂時丟失。（ Science, 236:806812）。端粒酶以其自身 RNA為模板，在染色體端部添加上端粒重復(fù)序列，并參與端粒長度和細(xì)胞增殖的調(diào)控。 vector實際上是 DNA分子 ， 是用來攜帶目的基因片段進(jìn)入受體細(xì)胞的 DNA。 4．操作時容易發(fā)生染色體機(jī)械切割。 BAC的優(yōu)點 1． 易于用電擊法轉(zhuǎn)化 （轉(zhuǎn)化效率比轉(zhuǎn)化酵母高 10
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