《單克隆抗體》ppt課件-全文預(yù)覽
【正文】 性抗體的陽(yáng)性孔，對(duì)陽(yáng)性集落孔進(jìn)行克隆 。 ? （ 2） 融合所用的瘤細(xì)胞一般是 HPRT與 TK缺陷型 ，因此也不能采用補(bǔ)救途徑合成 DNA。 ? 正常的脾細(xì)胞在培養(yǎng)基中存活僅 5～ 7天，無(wú)需特別篩選，細(xì)胞的多聚體形式也容易死去。 ? 將其放置于事先準(zhǔn)備好的 37℃ 水浴中，將 PEG緩緩加到混合細(xì)胞上，邊加邊輕輕攪拌，持續(xù) 90s后 ，移走水浴鍋，從 CO2培養(yǎng)箱取出溫育至 37℃ 的 50mL RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，用吸管吸取 10mL緩緩加到融合細(xì)胞上邊加邊輕輕攪拌（不能吹打），使細(xì)胞團(tuán)塊分散，先加 1mL，再加 2mL，再加 3mL，最后加完剩下的 4mL，加完第一個(gè) 10mL后，接著沿管壁加完剩下的 40mL，加完后，擰緊蓋，反復(fù)顛倒幾次，使細(xì)胞混勻。 取 1 107個(gè) SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與免疫睥細(xì)胞混合 ? （ 2）將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按 1： 10或 1： 5的比例混合在一起，在 50ml塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗 1次，離心，棄上清，用滴管吸凈殘留液體。 ? ⑷ 1700r/min，水平離心 10min后，取出離心管可見(jiàn)，在骨髓瘤細(xì)胞懸液和淋巴細(xì)胞分離液的交界處有一層白色的細(xì)胞，這就是骨髓瘤細(xì)胞，用10mL吸管吸走上層細(xì)胞懸液后，將中層的骨髓瘤細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到另一支滅菌 50mL離心管中，用15mLRPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液， 1200r/min， 5min,洗細(xì)胞兩次。計(jì)算細(xì)胞數(shù)目的公式為：每毫升細(xì)胞數(shù) =4個(gè)大方格細(xì)胞 105/4；或每毫升細(xì)胞數(shù) =5個(gè)中方格細(xì)胞數(shù) 106/2 骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備方法（二）： 飼養(yǎng)小鼠法 ? 將 Balb/c小鼠體內(nèi)生長(zhǎng)的 SP2/0骨髓瘤勻漿后制備SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，然后再用于融合，其制備步驟如下： ? ⑴將背部皮下長(zhǎng)出骨髓瘤的 Balb/c小鼠脫頸椎處死，用 75%的酒精浸泡 5min。 d、加入 30ml不完全培養(yǎng)基，同法離心洗滌一次。保證骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。加 5mL RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液到 玻璃勻漿器 中，將脾臟 進(jìn)行勻漿 ， 直到看不見(jiàn)紅色的組織塊，補(bǔ)加 5mL RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液到玻璃勻漿器中，混勻后靜置1min，待白色的組織塊沉到管底后，吸出上層細(xì)胞懸液8mL，轉(zhuǎn)移到 50mL離心管中，補(bǔ)加 8mL RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液到玻璃勻漿器后再轉(zhuǎn)移一次。 但除非抗原來(lái)源困難或有其它目的，我們?nèi)詫?shí)行舊法，因免疫反應(yīng)的啟動(dòng)機(jī)制非常復(fù)雜，生物整體的免疫反應(yīng)還是最可靠。 ? 2) 注意乳劑的生產(chǎn)要完全 ， 可取小量滴入水中，震動(dòng)后應(yīng)該不會(huì)散去 。 病毒誘導(dǎo)制備轉(zhuǎn)化脾細(xì)胞 ?有人直接取出健康的活化脾細(xì)胞，在培養(yǎng)中加入病毒體外誘導(dǎo)，以獲得能永久生長(zhǎng)的特異脾細(xì)胞系。 ? 工程菌表達(dá)為主。 ? 一種抗原通常具有多個(gè)不同的抗原決定族， 因此能刺激多個(gè) B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的單克隆抗體，因此血清中的抗體是針對(duì)不同抗原決定族的單克隆抗體混合物，稱為多克隆抗體。 2 抗體 P238 ? 動(dòng)物免疫系統(tǒng)分泌的中和或消除抗原物質(zhì)的影響的物質(zhì)，存在于血清中，本質(zhì)是免疫球蛋白 （ Immuniiglobbulin,Ig）。 ? 雜交瘤細(xì)胞：具有兩親本特性，生物制藥。 ? 體細(xì)胞雜交：克服有性不親和性，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)源遺傳 重組，在育種方面意義重大。 ? 特點(diǎn)：外源性、結(jié)構(gòu)性 （分子具有表面穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)基團(tuán)作為識(shí)別位點(diǎn)）、特異性（抗原與抗體的反應(yīng)）。 多克隆抗體與單克隆抗體 ? 動(dòng)物脾臟有上百萬(wàn)個(gè) B淋巴細(xì)胞，一個(gè)細(xì)胞就是一個(gè)克隆，它針對(duì)抗原上的一個(gè)抗原決定族產(chǎn)生的抗體是單克隆抗體。 ? 分子量數(shù)百至數(shù)千不等。 （一）歷史發(fā)現(xiàn) ? 1975年，英國(guó)劍橋大學(xué)分子生物學(xué)研究室將已適應(yīng)于體外培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫過(guò)的小鼠的脾細(xì)胞（ B淋巴細(xì)胞）進(jìn)行融合，發(fā)現(xiàn)融合形成的雜交瘤細(xì)胞具有雙親細(xì)胞的特征：既像骨髓瘤細(xì)胞一樣在體外培養(yǎng)中能夠無(wú)限地快速增殖，又能持續(xù)地分泌特異性抗體。 ? 單克隆抗體的特點(diǎn)是：理化性狀高度均一、生物活性單一、與抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域： ? ? ? ? ? ： ? 完全抗原：病毒、細(xì)菌、真菌等微生物和蛋白質(zhì)等分子量大于 5000Da生物物質(zhì) ? 半抗原：多糖、藥物、激素、肽類(lèi)等分子量小于 5000 Da 物質(zhì) ? 半抗原需與 BSA、 OA等載體交聯(lián)后成完全抗原才能刺激動(dòng)物產(chǎn)生可應(yīng)用的高效價(jià)的抗體 脾臟細(xì)胞獲得 ? 1) 小白鼠 (BALB/c
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