【正文】 602 OPG18/943 CCATCCATCCATTAATTTCCGCGATCCAATCGAACCACGATATGTGTAAAGCTATAGCATATCTACAGTCACTCCATGCTGCACCG 602 OPG18/972 CACAAAACACTCTAATCAGAATTAATTAATTAATTAATTATATAATCATCCATCCTATTTTAAATACATTAGCGGGTTTCCGTGTT 688 OPG18/943 CACAAAACACTCTAATCAGAATTAATTAATTAATTAATTATATAATCATCCATCCTATTTTAAATACATTAGCGGGTTTCCGTGTT 688 OPG18/972 TGTCGTTTGACCGCACATCTTATTTAACGAATTTATAAAAAAAATAAAAAAAAGTCGCGCATAAAATATTATTCATGTTTTATCAT 774 OPG18/943 TGTCGTTTGACCGCACATCTTATTTAACGAATTTATAAAAAAAATAAAAAAAAGTCGCGCATAAAATATTATTCATGTTTTATCAT 774 OPG18/972 CTAATAGCAACAAAAATACTAATCAAAAAGTTTAAAACAAAACGAACGATCAAACTTTAGACATAGAAATCCACATACATACTTAA 860 OPG18/943 CTAATAGCAACAAAAATACTAATCAAAAAGTTTAAAACAAAACGAACGATCAAACTTTAGACATAGAAATCCACATACATACTTAA 860 OPG18/972 AATGGAACGGAAGAAGTATATATACACCCTAGTTTACGACCTTAATTAGTCCTACTCCCCTGGACACTGCCCTCTTCTTTAATTAA 946 OPG18/943 AAGTTTACGACCTTAATTAGTCCTACTCCCCTGGACACTGCCCTCTTCTTTAATTAA 946 OPG18/972 CTAAATAATTAATTAACACATGAGCC 1032 OPG18/943 CTAAATAATTAATTAACACATGAGCC 1032 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 Sequences of primers for each SCAR locus derived from RAPD markers SCAR markers Primers origin Primers sequences Polymorphism SCAR/G18/883 OPG18/943 正向 : GGCTCATGTGCATGCATGCTTACT Dominant in N8m 反向 : GGACTAATTAAGGTCGTAAACTTTT SCAR/G18/890 OPG18/972 正向 : GGCTCATGTGCATGCATGCTTACT Dominant in N8 反向 : AGGGTGTATATATACTTCTTCCG SCAR/G18/919/948 OPG18/943 OPG18/972 正向 : GGCTCATGTGCATGCATGCTTACT Codominant in N8m and N8 反向 : AGTTAATTAAAGAAGAAGGCAGTGTCC SCAR/D10/1237 OPD10/1248 正向 : GTCTACACCTTATTATTGCACAC Dominant in N8 反向 : AAGATCGACTAAGGCGAGTACGAC SCAR/F03/1186 OPF03/1198 正向 : GATCACCTCCTCCTGTGAGCA Dominant in N8m 反向 : CACAACCATTGACAGTAACCAAGAAG 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 SCAR markers between Norin8 and Norin 8m M — λDNA+ EcoR I+Hind Ⅲ molecular marker 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?獲得了 5個(gè) SCAR標(biāo)記： ?SCAR/G18/890、 ?SCAR/G18/88 ?SCAR/G18/919/94 ?SCAR/D10/123 ?SCAR/F03/1186， 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 主題二、 任意引物 PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction， AP— PCR)標(biāo)記技術(shù) ?創(chuàng)立： Welsh和 McClilland等， 1990年。最終有 5個(gè)引物 OPT1 OPF0 OPG1OPE0 OPD10在農(nóng)林 8號(hào)和農(nóng)林 8號(hào) m之間擴(kuò)增出 7個(gè)多態(tài)性標(biāo)記，分別記作 OPT15/1100、 OPF03/1700、OPF03/119 OPG18/94 OPG18/97 OPE09/1900、OPD10/1248，這 7個(gè)多態(tài)性標(biāo)記 經(jīng) 3次重復(fù)結(jié)果穩(wěn)定一致。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?水稻苯達(dá)松敏感致死性狀作為一種化學(xué)致死標(biāo)記，由單個(gè)隱性核基因控制，因此，它在雜交稻生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。 1984年，日本 Mori k ， 農(nóng)林 8號(hào) 60Coγ射線 農(nóng)林 8號(hào) m 1999年，中國(guó)張集文等， W6154S 60Coγ射線 8077S(M8077S) ? Mori K、陳忠明等、張集文等通過(guò)遺傳學(xué)分析表明：兩種不同來(lái)源的苯達(dá)松敏感致死基因均為核控制的隱性單基因。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?實(shí)例二： RAPD擴(kuò)增克隆魚(yú) (B)、供體紅鯉 (A)、受體金魚(yú) (D)和雜交魚(yú) (C，即 A♂ xD♀ )的細(xì)胞核 DNA指紋圖譜。 SCAR標(biāo)記是將目標(biāo) RAPD 片段進(jìn)行克隆并對(duì)其末端測(cè)序，根據(jù) RAPD 片段兩端序列設(shè)計(jì)特異引物，對(duì)基因 DNA 片段再進(jìn)行 PCR特異擴(kuò)增，把與原 RAPD片段相對(duì)應(yīng)的單一位點(diǎn)鑒別出來(lái)。 （ 4）實(shí)驗(yàn)步驟少，技術(shù)簡(jiǎn)便，不涉及分子雜交和放射性自顯影等技術(shù)。L 加水至 20181。L Mg2+（ 15 mmol/L） 181。 ?擴(kuò)增結(jié)果可以是 1至多條帶 。 ?PCR 技術(shù) 1993 年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)（ Mullis），與開(kāi)創(chuàng)了 “ 寡核苷酸基因定點(diǎn)誘變 ” 加拿大籍英國(guó)科學(xué)家 Michael Smith共獲 。 ?延伸溫度和時(shí)間 溫度： 72℃ ，接近 Taq酶的最適 75℃ 時(shí)間：過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。 ?Taq DNA聚合酶特性： 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?Selection for DNA polymerase Klenow酶 早期采用 該酶不耐熱，缺點(diǎn)有 : ① 溫度要求低 (37℃) ，受熱即失活； ②產(chǎn)物特異性不高； ③積累大量的失活殘酶，使反應(yīng)產(chǎn)物純度大大降低； ④擴(kuò)增的最長(zhǎng)序列約 400bp（ Taq酶則能擴(kuò)增 10kb） 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?thermostable DNA polymerases ① Taq DNA polymerase ② Tth DNA polymerase— from ③ VENT DNA polymerase— from ④ Sac polymerase ⑤ pfu polymerase 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? mineral oil 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? PCR optimization ?變性溫度和時(shí)間 9295℃ ，富含 G和 C的序列，可適當(dāng)提高，但過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致酶活性損失。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?抑制劑 : 尿素、乙醇、 DMSO、 DMF、甲酰胺、 SDS 及許多其他化學(xué)藥劑。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? Taq DNA polymerase： from thermophilic bacteria. Taq polymerase from Thermus aquaticus. other thermostable DNA polymerase with greater accuracy used for certain applications. 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?Taq DNA聚合酶特性： ?分離 : 1969年，美國(guó)黃石國(guó)家公園溫泉。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? Primer design Most important!! (1)length: 20～ 30bp (2)G+C contents:ATCG random distributed (3)primers : no plementary sequence (4)3?end of the primer: no modification (5)5?end of the primer:product length， can be modified (6) specificity:less than 70% homology with nonspecific amplification sequence, or 8bp continuous plementary base 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? Primer designed with the help of puter ?DNA database ?conservative region parision, blast ?Primer designed software 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? buffer： ?1050 mmol/L TrisHCl(, 20℃) 。 ? 遺傳材料的基因組 DNA如果在特定引物結(jié)合區(qū)域發(fā)生 DNA片段插入、缺失或堿基突變，就有 可能導(dǎo)致引物結(jié)合位點(diǎn)的分布發(fā)生相應(yīng)的變化，導(dǎo)致 PCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子量變化。 ?用于做圖較費(fèi)時(shí)，難以分析大量樣品。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? RFLP標(biāo)記技術(shù)所用的儀器設(shè)備 ? 雜交箱 ? 紫外交聯(lián)儀 ? 同位素檢測(cè)儀 ? 水浴及搖床 ? 電泳及轉(zhuǎn)膜裝臵 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 三、 RFLP標(biāo)記特點(diǎn) ?優(yōu)點(diǎn)： ?共顯性，可以區(qū)別純合和雜合基因型。 使用磷屏儀，操作更方便。封好雜交盒后，臵65℃ 溫箱中振蕩過(guò)夜。 ?變性： mol/L NaOH， mol/L NaCl， 45 min。 即：物種的基因組 DNA在限制性內(nèi)切酶作用下，產(chǎn)生相當(dāng)多的大小不等的片段，用放射性同位素標(biāo)記的 DNA作探針，把與被標(biāo)記 DNA相關(guān)的片段檢測(cè)出來(lái)，從而構(gòu)建出多態(tài)性圖譜。 ?自從人的 RFLP圖譜構(gòu)建后，已經(jīng)分別構(gòu)建了果蠅、牛、大豆、小麥、水稻等多種生物的RFLP圖譜。它也是以以 PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?第三類是 一些新型的分子標(biāo)記 ，如： ?單核苷酸多態(tài)性（ Single nuleotide polymorphism, 簡(jiǎn)稱 SNP標(biāo)記）； ?表達(dá)序列標(biāo)簽（ Expressed sequences tags, 簡(jiǎn)稱 EST標(biāo)記）等。 （ 4） 表現(xiàn)為 “ 中性 ” ， 不影響目標(biāo)性狀的表達(dá) ， 與不良性狀無(wú)必然的連鎖 。 它能反映生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異特征的 DNA片段，它直接反映基因組 DNA間的差異。 ?電泳可區(qū)分 同一種酶（系統(tǒng)）的不同變化 。 ? 缺點(diǎn)： 結(jié)構(gòu)基因表達(dá)產(chǎn)物，對(duì)非結(jié)構(gòu)基因無(wú)能為力；所檢測(cè)位點(diǎn)只是基因組一部分；數(shù)量有限，有時(shí)受發(fā)育時(shí)期和環(huán)境影響。 二、遺傳標(biāo)記的 種類 基因組學(xué)