【正文】 該片段 13～ 663 bp與人核酸酶敏感元件結(jié)合蛋白 1 cDNA 839～ 1489 bp 100%同源 121 543 bp 該片段 16～ 514 bp與類似人 NADH脫氫酶 4 cDNA 1174～ 1672 bp 99%同源 212 408 bp 該片段 16～ 366 bp與人染色體 7上的 BAC 克隆 RP11 634H22 cDNA 25571～ 25221 bp 100%同源 Results of DNA sequencing and homologous analysis 141 263 bp 該片段 29～ 234 bp與人核糖體蛋白 L37a cDNA 130～ 335 bp 100%同源 161 427 bp 該片段 16～ 406 bp與人轉(zhuǎn)換蛋白 1 cDNA 13～ 403 bp 100%同源 171 1120 bp 該片段 118～ 1094 bp與人染色體 19上的 LLNLR 278H5 克隆 cDNA6440～ 5464 bp 99%同源 3 討論 AD/文庫質(zhì)粒及其與 BD質(zhì)粒的分離 酵母雙雜交系統(tǒng)的假陽性分析 篩選到的 8種相互作用蛋白的功能及其與蛋白激酶 CK2 的關(guān)系 人轉(zhuǎn)換蛋白 1的功能及其與蛋白激酶 CK2 的關(guān)系 ? 轉(zhuǎn)換蛋白 (transition proteins,TPs)，主要有轉(zhuǎn)換蛋白 1（ TP1） 和轉(zhuǎn)換蛋白 2（ TP2）兩種類型。 3: 11。 6: 16 。 2: 6。 用誘餌質(zhì)粒 pGBKT7HCK2α′篩選文庫 (1) 酵母 AH109(pGBKT7HCK2 α′）感受態(tài)制備 (醋酸鋰法） (2) 文庫轉(zhuǎn)化（分步轉(zhuǎn)化法 ) (3) 檢測文庫轉(zhuǎn)化效率 (4) 初步篩選陽性候選克隆 轉(zhuǎn)化混合物接種在 75塊 SD/His/Leu/Trp培養(yǎng)基中 陽性克隆重新在 SD/Ade/His/Leu/Trp培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng) β半乳糖苷酶濾膜影印法初步篩選出陽性候選克隆的轉(zhuǎn)化株 2 結(jié)果 文庫的擴增與抽提 文庫滴度為 109 cfu /ml ； 文庫轉(zhuǎn)化效率為 105 cfu/μg ； 共得轉(zhuǎn)化子約 107 β半乳糖苷酶濾膜影印分析法鑒定的真陽 性克隆結(jié)果 138個克隆呈現(xiàn)藍色，為陽性候選克隆 3 討論 ?酵母株 AH109的表型 (Ade， His， Leu， Trp ） 及用以篩選的原理 ?酵母篩選的嚴(yán)謹(jǐn)性 ?高嚴(yán)謹(jǐn)性 ?低嚴(yán)謹(jǐn)性 ?最低嚴(yán)謹(jǐn)性 第二部分 相互作用蛋白的進一步確證、 cDNA序列測定及其同源性分析 pGADT7Rec AD 載體 共轉(zhuǎn)化感受態(tài) 酵母菌 AH109 總 RNA HL60細(xì)胞 HL60細(xì)胞 cDNA文庫 人 CK2α39。反向雙雜交系統(tǒng)作為正向雙雜交系統(tǒng)的補充，提出了創(chuàng)建整個有機體蛋白質(zhì)連鎖圖譜的設(shè)想。 ? 利用這種方法能方便地鑒定 作用缺陷等位基因 、 解離肽或相關(guān)的小分子物質(zhì) 。 ③定位已經(jīng)證實的具有相互作用的 DNA結(jié)合蛋白的 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及準(zhǔn)確定位與 DNA結(jié)合的核苷酸序列。 ? 該系統(tǒng)不僅適用于識別轉(zhuǎn)錄因子，也適用于研究參與轉(zhuǎn)錄抑制和 DNA復(fù)制過程的蛋白質(zhì)。 Wang MM, Reed RR. Molecular cloning of the olfactory neuronal transcription factor Olf1 by geic selection in yeast. Nature， 1993， 364(6433):121126. 文獻出處 酵母單雜交系統(tǒng)原理 ? 在酵母單雜交系統(tǒng)中，省略了在酵母雙雜交系統(tǒng)中采用的 BDX蛋白質(zhì)雜交體，而用特異的DNA序列取代 DNA Gal4結(jié)合位點。這限制了某些細(xì)胞外蛋白和細(xì)胞膜受體蛋白等的研究 陽性克隆必須進行體外翻譯和表達，用抗原表位特異性的抗體進行共定位研究。在細(xì)胞表面發(fā)生的相互作用可采用 噬菌體顯示系統(tǒng) 。 兩個蛋白本應(yīng)發(fā)生相互作用，但報告基因不表達或表達程度甚低以至于檢測不出來。 ③一些實際沒有相互作用的蛋白但有相同的模體蛋白也可發(fā)生相互作用。 ④優(yōu)化 3AT(3aminotriazole)濃度。應(yīng)對誘餌和靶蛋白分別作單獨激活報告基因的鑒定。這種融合蛋白的激活作用被外來蛋白激活。 利用酵母雙雜交技術(shù)，將所有已知基因和 EST序列為誘餌，在表達文庫中篩選與誘餌相互作用的蛋白，從而找到基因之間的聯(lián)系，建立基因組蛋白連鎖圖。而在 細(xì)胞體內(nèi) 的抗原和抗體的聚積反應(yīng)則可以通過酵母雙雜交進行檢測。 ? 分析新基因的生物學(xué)功能。 4. 廣泛性。 2. 真實性。該載體中可加入進行營養(yǎng)型篩選的基因。 Gal4的 DNABD可識別位于 Gal4效應(yīng)基因的UAS，并可與之結(jié)合； Gal4的 AD則可與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中其他成分結(jié)合，激活 UAS下游報告基因 LacZ的轉(zhuǎn)錄。 當(dāng) Gal4的兩個結(jié)構(gòu)域位于不同肽鏈上，只要它們在空間上充分接近，則能恢復(fù) Gal4作為轉(zhuǎn)錄因子的活性。 Gal4為酵母半乳糖苷酶基因 gal1的轉(zhuǎn)錄激活因子，天然的 Gal4分子是由一條由 881個氨基酸殘基組成的多肽鏈。 該技術(shù)既可用來研究 哺乳動物 基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用，也可用來研究 高等植物 基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用。第十八章 用酵母雙雜交系統(tǒng)研究蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)相互作用 劉新光 蛋白質(zhì)之間相互作用研究的重要性 蛋白質(zhì)之間