【正文】 第十八章 用酵母雙雜交系統(tǒng)研究蛋白質 蛋白質相互作用 劉新光 蛋白質之間相互作用研究的重要性 蛋白質之間相互作用以及通過相互作用而形成的蛋白復合物是細胞各種基本功能的主要完成者。 幾乎所有的重要生命活動，包括 DNA的復制與轉錄、蛋白質的合成與分泌、信號轉導和代謝等等，都離不開蛋白質之間的相互作用。 研究蛋白質相互作用的常用方法 ?酵母雙雜交（ yeast two hybridization） ?親和層析 ?免疫共沉淀 ?蛋白質交聯(lián) ?基于 GFP的細胞內蛋白質相互作用的研究方法 ?噬菌體顯示系統(tǒng)篩選 酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物 酵母中進行的，研究 活細胞內 蛋白質相互作用，對蛋白質之間微弱的、瞬間的作用也能通過報告基因 的表達產物敏感地檢測得到。 第一節(jié) 酵母雙雜交系統(tǒng)簡介 它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質之間關系的技術。 該技術既可用來研究 哺乳動物 基因組編碼的蛋白質之間的相互作用，也可用來研究 高等植物 基因組編碼的蛋白質之間的相互作用。 一、酵母雙雜交系統(tǒng)的建立和基本原理 經典文獻出處 ? Fields S, Song O. A novel geic system to detect proteinprotein interactions. Nature, 1989, 340(6230):245246 （一）酵母雙雜交系統(tǒng)的建立 1989年美國紐約州立大學的 Fields和 Song首先描述了酵母雙雜交系統(tǒng) (yeast twohybrid system)。 該系統(tǒng)的建立是基于對真核生物調控轉錄起始過程的認識。真核生物基因轉錄需要反式轉錄激活因子的參與，真核生長轉錄因子含有兩個不同的結構域： 轉錄激活因子 DNA結合結構域 (BD) (DNA binding domain) 轉錄激活結構域 (AD) (activation domain) 這兩個結構域各具功能，互不影響 , 單獨存在時沒有轉錄激活的功能，只有兩者通過共價或非共價鍵連接建立起來的空間結構方可表現(xiàn)出一個完整的激活特定基因表達的激活因子的功能。 Gal4為酵母半乳糖苷酶基因 gal1的轉錄激活因子，天然的 Gal4分子是由一條由 881個氨基酸殘基組成的多肽鏈。 兩個結構域中的 DNABD由位于 N末端的1～ 147位多肽構成，能識別位于 Gal4基因的上游激活序列 (upstream activation sequence，UAS)。 此外，在其 N端還具有一段核定位序列。AD由位于 C末端的 768～ 881位多肽構成。 當 Gal4的兩個結構域位于不同肽鏈上，只要它們在空間上充分接近，則能恢復 Gal4作為轉錄因子的活性。 Fields和 Song將兩個融合蛋白分別構建在穿梭質粒上，一個是將 Gal4的 DNABD與酵母蛋白SNF1融合；另一個是將 Gal4的 AD和酵母蛋白SNF4融合。 其中， SNF1是一種絲氨酸 /蘇氨酸的蛋白激酶， SNF4是它的一個結合蛋白， 這兩種蛋白是已知可以相互作用的 。 當兩種穿梭質粒共轉化含有 Gal4結合位點的報告基因 LacZ的酵母菌株后，通過 SNFl與 SNF4的相互作用， Gal4的 DNABD與 Gal4的 AD靠近 , 形成一個大的復合物 Gal4BDSNF1SNF4Gal4AD。 Gal4的 DNABD可識別位于 Gal4效應基因的UAS，并可與之結合； Gal4的 AD則可與轉錄復合物中其他成分結合，激活 UAS下游報告基因 LacZ的轉錄。 酵母轉錄因子（ Gal 4） 與 BDfusion 誘餌（ bait） 與 ADfusion 獵物或靶蛋白（ prey or target protein） 報告基因（ reporter gene） Lac Z（編碼 β 半乳糖苷酶） （二）酵母雙雜交系統(tǒng)的原理 AD Y AD Y X DNABD GAL4 UAS Promoter lacZ(or HIS) reporter gene transcription GAL4 UAS Promoter lacZ(or HIS) reporter gene GAL4 UAS Promoter lacZ(or HIS) reporter gene X DNABD 酵母雙雜交動畫演示（英文） 酵母細胞 作為報道株的酵母雙雜交系統(tǒng)具有 許多優(yōu)點 : ? 易于轉化、便于回收擴增質粒 ? 具有可直接進行選擇的 標記基因 和特征性 報告基因 ? 酵母的內源性蛋白不易同來源于哺乳動物的蛋白相 互結合 報道株 經 改造 的、含報告基因的重組質粒的宿主細胞。 ? 基因組中 GAL4基因 是缺失型的 ? 基因組中引入額外的報告基因 LEU、 TRP、 HIS 改造后的酵母細胞的特點： 通過功能互補和顯色反應篩選到陽性菌落 ? 表達“誘餌”和“獵物”蛋白； ? 檢驗這兩種蛋白表達后能否激活酵母中的報告基因。 做法：首先構建能表達 “誘餌”和“獵物”蛋白的表達載體。該載體中可加入進行營養(yǎng)型篩選的基因。 二、酵母雙雜交系統(tǒng)的基本策略 三、酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點 1. 高敏感性。 原因： ①采用高拷貝和強啟動子的表達載體，使融合蛋白過量表達； ②激活結構域和結合結構域結合形成轉錄起始復合物，之后又與啟動子結合，此三元復合體使融合蛋白各組分間結合更趨于穩(wěn)定； ③通過 mRNA使信號放大； ④檢測的結果是基因表達產物的累積效應，可檢測存在于蛋白質間的微弱或暫時的相互作用。 三、酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點 1. 高敏感性。 2. 真實性。 檢測在活細胞內進行，作用條件與作用力無需模擬，在一定程度上代表細胞內的真實情況。 3. 簡潔性。 融合蛋白相互作用后，減少了制備抗體和純化蛋白質的繁瑣步驟。 4. 廣泛性。 采用不同組織器官細胞類型和分化時期的材料構建 cDNA文庫，能分析不同亞細胞部位和功能的蛋白質，適用于部分細胞質、細胞核及膜結合蛋白。 ? 分析已知蛋白之間的相互作用 ? 對蛋白質功能域的分析，如可將待測蛋白質進行點突變或缺失突變再進行雙雜交。 ? 用已知功能蛋白質篩選雙雜交 cDNA文庫，研究蛋白質之間相互作用的傳遞途徑，發(fā)現(xiàn)新基因。 ? 分析新基因的生物學功能。即以功能未知的新基因去篩選文庫，再根據篩的已知基因推測新基因功能。 ? 繪制蛋白質相互作用系統(tǒng)圖譜 ? 在藥物