【正文】 2022, 18 (2) :227～ 233. 。伊力 , 馬慶苓 , 阿吉艾克拜爾 我要感謝在實驗過程中在實驗儀器方面提供各種幫助給 我的化工學(xué)院的儀器管理老師杜老師，感謝在實驗室中提供給我各種幫助的研究生的學(xué)長學(xué)姐們，有不懂的地方總會耐心為我指導(dǎo)，讓我的實驗中少走了許多彎路。首先要感謝我的徐丹老師， 從論文的選題、設(shè)計、試驗及論文的定稿，都傾注了大量的心血。 （ 3） 在固體培養(yǎng)熒光性觀察下，發(fā)現(xiàn)孜然精油對黃曲霉 產(chǎn)毒能力也有一定的抑制效果，但未進一步研究其機理，可采用 薄層層析法研究其對黃曲霉 產(chǎn) AFB1能 力的影響 [ 22, 23,24]。 展望 （ 1）本研究發(fā)現(xiàn)，在孜然精油提取方面，采用的兩種方法提取率均不是很高，為了進一步提高其精油得率，在水蒸餾方法中，可在得出油水混合物后直接將油水分離開來，再加入一定量的無水硫酸鈉除去多余的水分，提高精油得率。 （ 3） 每隔 24 h 在 365 nm 紫外儀下拍照觀察其熒光性可知，孜然精油對黃曲霉 的產(chǎn)毒能力有一定的抑制作用，使其與對照組比較熒光性較弱。該方法把鑒定 DNA 損傷的化學(xué)檢測推進到數(shù)值化研究范圍，對活態(tài)細(xì)胞代謝及毒理學(xué)的研究具有重要理論和應(yīng)用價值 [25]。實驗組中，黃曲霉孢子未見發(fā)芽管，且孢子大小明顯小于對照組的；結(jié)果表明孜然精油能顯著抑制黃曲霉孢子的萌發(fā)，并對孢子有破壞作用 [ 17]。真菌細(xì)胞壁的多糖成分、細(xì)胞膜的麥角固醇是真菌 細(xì)胞所特有，因此，抑制這些成分的生物合成必將破壞真菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，而起到抗真菌作用，故這些生物代謝途徑已成為研究抗菌機理的重要靶位。 培養(yǎng) 24 h 后采用棉蘭染色法挑取少許菌絲在顯微鏡下進行觀察， 具體圖像如下： （ a）對照組 （ b）水蒸餾 （ c）亞臨界 圖 36 黃曲霉 菌絲體的顯微鏡觀察圖， a (400 倍 )：菌絲體未經(jīng)孜然精油處理； b (400 倍 )與 c (400 倍 )：菌絲體經(jīng)孜 然精油處理 如上圖所示，對照組中，黃曲霉菌絲體粗壯飽滿，表面布滿了顆粒狀的小突起；而經(jīng)孜然精油處理后，找到的菌絲體較少，菌絲體發(fā)生扭曲，嚴(yán)重收縮，菌絲體較細(xì)，表面變得光滑。 紫外線對黃曲霉產(chǎn)毒的抑制則很可能是通過破壞 DNA 影響黃曲霉基因組的正常轉(zhuǎn)錄來實現(xiàn)的，因為可見光下培養(yǎng)可以部分恢復(fù)黃曲霉菌的產(chǎn)毒能力，而這種恢復(fù)正是由于光照誘導(dǎo)光復(fù)活酶修復(fù)了紫外線所造成的 DNA 損傷。 時間 /天 水蒸餾 /% 亞臨界 /% 1 2 3 4 5 常用植物香料提取液對黃曲霉抑制效果的研究 19 圖 33 實驗組黃曲霉 圖 34 實驗組黃曲霉 如上圖 33.， 34分別為黃曲霉生長直徑隨時間變化的趨勢圖及兩種不同方法提取出的孜然精油對黃曲霉生長直徑的抑制率隨時間變化的趨勢圖，可以看出，二者對黃曲霉生長均有良好的抑制效果，并且無顯著性差異，且抑制率均在 80%左右。 177。 177。 2 177。 順式 β金合歡烯 C15H24 姜黃烯 C15H22 1姜烯 C15H24 α金合歡烯 C15H24 γ衣蘭油烯 C15H24 L 紅沒藥醇 C15H24 β倍半水芹烯 C15H24 胡蘿卜醇 C15H26O 姜酮 C11H14O3 醋酸檜酯 C12H18O2 葉綠醇 C20H40O 棕櫚酸（ CAS） C18H36O2 十六烷酸，乙基酯 C18H36O2 順式 11,14二十碳二烯酸甲酯 C21H38O2 油酸 C18H36O2 亞油酸乙酯 C20H36O2 （ E） 9 十八烯酸乙酯 C20H38O2 篙屬酮 C10H16O 陜西科技大學(xué)畢業(yè)論文 18 固體培 養(yǎng)直徑測量的結(jié)果與討論 通過固體培養(yǎng) (生長接觸法 ) 每隔 24 h 用十字交叉法測量黃曲霉的生長直徑，并且在 365 nm 紫外儀下拍照，記錄它的熒光性。從化合物種類來看，兩地精油的共性主要成分均有 枯茗醛， 二氯甲烷， γ松油烯， β蒎烯， 鄰 傘花烴等 ， 由此可見， 兩種不同方法提取的 的孜然精油主要成分基本相同，但含量存在差異。亞臨界萃取得到精油共檢測出 57 個成分，鑒定了占精油含量 %的 50 個成分（圖 32）。需陜西科技大學(xué)畢業(yè)論文 12 用多層 保鮮膜包裹后于 4℃ 冰箱中保存?zhèn)溆谩? 亞臨界萃取技術(shù)是近十幾年來剛剛興起的一種新型萃取技術(shù)，具有萃取時間短、效率高、能耗低、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點，但仍然存在著萃取率有待提高的問題，且當(dāng)樣品不同時，需清洗儀器，存在儀器清洗不干凈問題，導(dǎo)致精油中有可能混有其他樣品，降低了精油的純度。 該方法但在蒸餾過程中植物原料受熱焦化，易導(dǎo)致熱不穩(wěn)定成分揮發(fā)損失和分解，對有些組分有大的破壞作用，進而影響精油的質(zhì)量和試驗結(jié)果。 28℃ 下 培養(yǎng) 10 h，分別于 0、 10h分別 用顯微鏡分析觀察黃曲霉孢子的萌發(fā) 狀態(tài)，記錄并分析圖像。 （ 2） 繼 續(xù)培養(yǎng) 24 h后采用棉蘭染色法挑取少許菌絲在顯微鏡下進行觀察分析，觀察兩種不同方法提取出的孜然精油對 黃曲霉 ， 同時觀察不經(jīng)孜然精油處理的黃曲霉菌絲體形態(tài)， 記錄并分析圖像。 培養(yǎng)期為 57天。 （ e）將培養(yǎng)基全部倒置放在 28℃下培養(yǎng)。 （ a）將溶化的培養(yǎng)基分別倒 入平皿中各 20 mL，混勻，待凝固。 （ 2 ） 孢子懸浮液的制備：用 2 ml 左右的無菌生理鹽水將黃曲霉斜面上的孢子沖洗下（采用第一代黃曲霉），倒入棕色小瓶，然后放在搖床上震蕩，使成團的孢子打散。 80℃浸泡 1 h，用紗布過濾，然后補足失水至所需體積。 GCMS 條件 ： （ 1） 色譜條件：色譜柱 ： DB5 30 （ μm） film； （ 2） 溫度：氣化室溫度 250℃ ； （ 3） 程序升溫 ： 40℃ （ 3 min）以 10℃ /min 上升到 90℃ ， 再以 8℃ /min 上升到 250℃ （ 8min）； 進樣量 μL； 載氣 ： 氦氣 ； 流量 ： 1ml /min； 分流比 60： 1。 用無水乙醚萃取餾出液，每次加乙醚約 90ml ，萃取三次， （ 餾出液與乙醚比例為 1:1） 將三次乙醚萃取液合并，萃取液以無水硫酸鈉干燥后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑獲 得精油。 實驗儀器與設(shè)備 常用植物香料提取液對黃曲霉抑制效果的研究 7 表 21 所需儀器與設(shè)備 設(shè)備名稱 設(shè)備型號 生產(chǎn)廠家 1000 ml 三口燒瓶 蒸餾頭 蛇形冷凝管 尾接管 接受瓶 分液漏斗 打孔器 亞臨界工藝技術(shù)裝置 FA2022 常州市特威電氣自動化系統(tǒng)有限公司 電子天平 722N 上海精密科學(xué)儀器有限公 司 電子調(diào)溫萬用電爐 DK98Ⅱ 天津市泰斯特儀器有限公司 OPTEC 奧特光學(xué)生物顯微鏡 BK5000 重慶奧特光學(xué)儀器有限公司 顯微鏡數(shù)碼顯像系統(tǒng) S/N T3003581 西安中顯光電科技有限公司 隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 PYXDHS50X65BSII 生物安全柜 BSC1300A2 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠 快速混勻器 手提式壓力蒸汽滅菌器 YXQSG4628OS 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 RE52A 上海亞榮生化儀器廠 陜西科技大學(xué)畢業(yè)論文 8 實驗方法 孜然精油的提取 （ 1）傳統(tǒng)水蒸餾法 原料處理方法：采回后經(jīng) 60℃ 烘干、粉碎 ,過 60 目篩后于一 45℃ 冰箱中保存?zhèn)溆谩? 陜西科技大學(xué)畢業(yè)論文 6 2 實驗材料與方法 實驗材料 實驗菌株 Aspergillus flavus CGMCC 購于中國普通微生物菌種保藏管理中心， PDA 培養(yǎng)基 4℃ 保存。 （ 4） 研究其對黃曲霉菌絲體形態(tài)的影響。將油水直接分離或用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑出去。鑒于化學(xué)防 腐劑使用條件所限、長期使用會產(chǎn)生生物抗藥性和累積性毒害等缺點，目前人們已將目光轉(zhuǎn)向從生物中尋找天然抗菌活性成分（如香精油）作為防腐劑并已成回歸自然的時尚。張應(yīng)烙等（ 2022） 報道孜然精油對蘋果霉心病菌、棉花枯萎病菌、白菜黑斑病菌、小麥紋枯病菌表現(xiàn)出強烈的抑制作用 [16]。李偉等（ 2022） 對孜然精油抑菌活性進行了初步的研究，發(fā)現(xiàn)孜然精油對米曲霉、黑曲霉、根霉、枯草芽胞桿菌、白色葡萄球菌和大腸桿菌有很強的抑制作用 [13]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，最佳工藝條件陜西科技大學(xué)畢業(yè)論文 4 為：浸泡時間 h、 微波功率 200 W、提取時 間 45 min， 在此條件下精油提取率為 %[11]。巴拉提 （ 2022） 研究同時蒸餾萃取法提取新疆孜然精油的提取工藝，在最佳提取工藝條件下，孜然精油的萃取得率為 %， 同時對孜然精油進行物理化學(xué)分析，表明孜然精油性質(zhì)穩(wěn)定，且具有非常高的應(yīng)用價值。曾家豫等 （ 2022）采用水蒸氣蒸餾法提取孜然精油 , 研究了提取時間對精油得率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蒸餾 3 h，揮發(fā)油得率達到最大值 [8]。 孜然精油的研究概況 目前最常用的孜然精油的提取方法主要有超臨界 CO2 萃取、亞臨界萃取、水蒸餾法、微波輔助萃取以及有機溶劑萃取法等。人類使用孜然作為調(diào)味料已有二千多年的歷史。孜然原產(chǎn)于埃及、埃塞俄比亞，我國新疆、甘肅河西走廊地區(qū)有大量種植，前蘇聯(lián)、地 中海地區(qū)、伊朗、印度及北美也有栽培。 物理方法中，常見的有見的有紫外線照射法。家庭自制發(fā)酵食品也能檢出黃曲霉毒素，尤其是高溫高濕地區(qū)的糧油及制品種檢出率更高。 AFT 的致癌力也居首位，是目前已知最強致癌物之一 。 B1 是最危險的致癌物 ， 經(jīng)常在玉米，花生，棉花種子，一些干果中常能 檢測到。黃曲霉毒素 B1 在激發(fā)波長 365 nm 下會激發(fā)出熒光。 一般在中性溶液中較穩(wěn)定 ， 但在強酸性溶液中稍有分解 ， 在 pH910 的強堿溶液中分解迅速 。 B1， B2， G1， G2， M1 和 M2 的在分子結(jié)構(gòu)上十分接近。 上 世紀(jì) 60 年代，在英國發(fā)生的十萬只火雞突發(fā)性死亡事件被確認(rèn)與從巴西進口的花生粕有關(guān) .進一步的調(diào)研證明，這些花生粕被一種來自真菌的有毒物質(zhì)污染，這些研究工作最終使人們發(fā)現(xiàn)了黃曲霉（ ） 產(chǎn)生的有 毒代謝物質(zhì)，黃曲霉毒素（ Aflatoxins） 。菌體有許多復(fù)雜的分枝菌絲構(gòu)成。實驗組黃曲霉孢子未見發(fā)芽管，且孢子大小明顯小于對照組的；結(jié)果表明孜然精油能顯著抑制黃曲霉孢子的萌發(fā)，并對孢子有破壞作用。