【正文】 改良線栓法，將血管內(nèi)插線改用頭端尖銳的 30單股絲線，由一側(cè) ECA進(jìn)入，導(dǎo)入同側(cè) ICA至頸動脈分叉處時，用線段的尖端刺破該動脈的分叉部，抽出導(dǎo)線，即可產(chǎn)生 SAH模型。 ? 一 、 無癥狀性 CVS模型 ? （ 一 ） 顱內(nèi)動脈刺破法 ? 1． 開顱法 開顱暴露實(shí)驗(yàn)動脈 ， 于該動脈處置一絲線并引出線的末端埋藏于皮下 ， 若干天后將線抽出 ， 造成相應(yīng)的動脈破裂及蛛網(wǎng)膜下腔出血 。 第六節(jié) 蛛網(wǎng)膜下腔出血模型 ? 理想的蛛網(wǎng)膜下腔出血 （ SAH） 所致腦血管痙攣 （ CVS） 動物模型應(yīng)符合下列條件：動物出現(xiàn)的 CVS的癥狀與人類 CVS的癥狀相似；制作簡單 、 費(fèi)用低；所用動物腦血管變異較少；可以控制 CVS的程度；可用此模型進(jìn)行慢性實(shí)驗(yàn)；可在一定的部位有較高的腦缺血發(fā)生率；有類似動脈瘤破裂時動脈壁的損傷；有急性顱內(nèi)壓增高的表現(xiàn)；在蛛網(wǎng)膜下腔中有足夠的血凝塊 。 20周鼠齡SHRSP食用高 Na+低 K+飲食 ， 很快就發(fā)生非常明顯的卒中 ， 大約 100%死于出血性卒中 。病變過程與急性梗死性出血相似。誘導(dǎo)后 2h既有明顯的血腫區(qū)形成，有的血腫區(qū)內(nèi)還可出現(xiàn)較大的血凝塊。 血腫的體積與注入的膠原酶呈劑量依賴性 。 ? （ 二 ） 膠原酶誘導(dǎo)腦出血模型 ? 實(shí)驗(yàn)研究表明 ， 用含 ~鹽水 2μl， 通過立體定向術(shù)經(jīng)微量注射器于 9min內(nèi)注入尾殼核 ， 。 ? 模型制備方法：新生 Beagle幼犬（生后 12~72h）， 體重 208~405g， 氣管切開人工通氣維持在 PO2在 40~60mmHg，PCO2在 30~40mmHg。 根據(jù)臨床病理學(xué)研究 ， 新生兒顱內(nèi)出血可能與腦缺血 、 高碳酸血癥 、 全身血容量和血壓大幅度變化有關(guān) 。 微氣囊充脹法能產(chǎn)生一致的 、 可重復(fù)的腦損害 ， 避免了腦內(nèi)注血所出現(xiàn)的血液進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔或破入腦室以及血腫形態(tài)不一的缺陷 。光鏡下，尾殼核注血后血腫上方的皮質(zhì)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)性損害。大鼠腦容量約 2ml， 因而鼠腦 1μl出血量約相當(dāng)于人腦 。 兔平均腦重約 30g， ~體積 3%~5%的注血量相當(dāng)于人腦 50~70ml左右的出血量 。 大鼠等小動物多用立體定向方法注血 ，大動物如狗和猴等三種方法都可采用 。由于大鼠具有：①腦血管解剖及生理較接近人類；②腦體積較少，易于病理學(xué)及生化學(xué)觀察；③價格低廉且容易管理和實(shí)施手術(shù)；④生理、生化、藥理、形態(tài)學(xué)方面實(shí)驗(yàn)資料豐富，易于比較。值得注意的是，在電灼雙側(cè)椎動脈時，應(yīng)將組織分離完全，充分暴露雙側(cè)的翼小孔內(nèi)的椎動脈，否則，電灼椎動脈容易失敗。 ? 五 、 四血管閉塞 （ 4VO） 全腦缺血模型 ? 1979年， Pulsinelli首先建立了 4VO全腦缺血模型。 雖然部分出現(xiàn) ACA供應(yīng)區(qū)腦組織缺血損害 ， 但仍以 MCA供應(yīng)區(qū)損害為主 ，故仍是可以選用的 MCAO模型 。 動物蘇醒后 ， 一般不出現(xiàn)病灶對側(cè)前趾屈曲或爬行向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈 。 2min后以 3000勒克斯（ lx） 的光照度照射 10min。本模型的缺點(diǎn)是結(jié)扎一側(cè)動脈不一定全部發(fā)生腦梗死 ， 而且一旦發(fā)生大面積梗死 ， 多數(shù)動物會在短時間內(nèi)死亡 ， 使實(shí)驗(yàn)中斷 ， 不適用于慢性實(shí)驗(yàn) 。 ? 3． 評價標(biāo)準(zhǔn) Kahn曾做過歸納總結(jié)：一側(cè)動脈搏動停止；對側(cè)后肢外張；對側(cè)足指伸展不對稱 ， 肌肉無力；動物爬行時向手術(shù)側(cè)轉(zhuǎn)圈；手術(shù)側(cè)眼瞼下垂 。 因此 ， 一側(cè)頸總動脈阻塞時 ， 該側(cè)的大腦中 、 后動脈必須通過對側(cè)相應(yīng)的大腦動脈供血區(qū)的血液提供營養(yǎng) ， 因而結(jié)扎一側(cè)頸總動脈即可導(dǎo)致腦梗死 。 ? 4．優(yōu)缺點(diǎn) 該模型的優(yōu)點(diǎn)是不需要特殊設(shè)備、不開顱，栓塞部位容易控制、成功率較高、重復(fù)性較好，栓塞機(jī)理與臨床腦血栓的機(jī)理較為接近。 ? ② 大鼠缺血再灌注 24h斷頭取腦斷頭后迅 ?速取腦 ， 不固定 ， 連續(xù)冠狀切片 ， 片厚 1mm。 ? 3． 評價指標(biāo) ? （ 1） 動物蘇醒后 ， 手術(shù)側(cè)出現(xiàn) Horner征 ， 提尾手術(shù)對側(cè)前肢屈曲或爬行時向手術(shù)對側(cè)轉(zhuǎn)圈者入選 。 ? 缺血后（時間根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而定）拔出絲線至有阻力感，說明絲線頭部已離開 ICA而位于ECA內(nèi)，將體外的絲線剪斷，完成缺血再灌注動物模型的制備。動物腹腔注射麻醉 ， 仰臥固定于手術(shù)臺上 ， 頸部正中切口 ， 暴露左側(cè) （ 或右側(cè) ， 根據(jù)需要而定 ）頸總動脈 （ CCA） 、 頸外動脈 （ ECA） 、 頸內(nèi)動脈 （ ICA） ， 注意勿過度刺激迷走神經(jīng) 。目前最常用的為大鼠 ， 兔 、 小型豬 、 猴等動物也可應(yīng)用線栓法建立此類模型 ， 本書不做贅述 。 第四節(jié) 腦缺血再灌流模型 ? 缺血性腦血管病是急性腦血管病中最常見的類型 ， 因而用于腦缺血 / 再灌流(MCAO/R)研究的動物模型也較多 。腎性高血壓模型需經(jīng)過一定的手術(shù)或其它附加因素處理，與人類高血壓病的臨床不完全一致，但它有如下優(yōu)點(diǎn)，①血壓升高較明顯，持久和恒定，容易反應(yīng)出藥物的降壓作用。 SHRSP出生后出現(xiàn)嚴(yán)重高血壓外 ， 90%以上出現(xiàn)腦出血和腦栓塞； 20周鼠齡 SHRSP食用高 Na+低 K+飲食 ， 很快就發(fā)生非常明顯的卒中 ，大約 100%死于出血性卒中 。 ? 五 、 鈉負(fù)荷高血壓模型 ? 用高濃度鹽水作為日常飲水喂養(yǎng) Saltsensitive大鼠 （ SStrain） 誘發(fā)高血壓 ， 大鼠血壓會超過 180mmHg。 即使停止應(yīng)用鹽皮質(zhì)激素 ， 動物的高血壓 、 多尿 、 尿鈉消失現(xiàn)象也會持續(xù)下去 。 也可肌肉注射垂體后葉素配合電刺激 ， 一般兔在實(shí)驗(yàn)后 11天 、 大鼠 30天 、 狗 35天即出現(xiàn)血壓升高 ， 在實(shí)驗(yàn)觀察的 2~3個月內(nèi) ， 動物血壓會始終保持穩(wěn)定的升高狀態(tài) ， 而且動物死亡率很低 。 ? 三 、 神經(jīng)源性及應(yīng)激性高血壓動物模型 ? 1． 基本原理 長期的應(yīng)急反應(yīng)造成交感神經(jīng)系統(tǒng)張力增高和垂體 腎上腺素軸系統(tǒng)過度分泌 ， 從而引起全身小血管收縮 ， 最終導(dǎo)致高血壓 。 ? 二 、 腎外包扎性高血壓模型 ? 1． 基本原理 與腎動脈狹窄性高血壓模型相同 。 ? 2．實(shí)驗(yàn)方法 成年健康大鼠（兔或狗），體重 150~200g， 性別不限。全身小動脈的痙攣與遺傳、精神刺激、應(yīng)激、腎臟缺血、腎上腺皮質(zhì)的作用及鈉的作用等諸多因素有關(guān)，目前高血壓動物模型的復(fù)制多以不同角度模擬高血壓這些易患因素而形成，動物多選用大鼠、犬、貓、家兔、猴。 ? 2級 動脈內(nèi)膜粥樣斑塊占血管腔面積的 1/2。 也可將左心室 、 右心室及室間隔三部分心肌分別固定各橫切成 3塊 ， 切片染色后檢查并計算其有粥樣斑塊的小動脈數(shù)及其等級 。 ? Ⅳ 級：動脈粥樣硬化病變面積 34%~50%（ 1/2） 。 然后將主動脈貼于玻璃板上 ， 用厚度均勻的白紙描繪出主動脈壁及粥樣斑塊的圖形 ， 把斑塊部分剪下來 ， 再將粥樣斑塊及動脈壁的圖形分別稱重或計算面積 ， 即可計算出斑塊重量或面積占主動脈管壁總重量或總面積的百分比 。 ? 2級 粥樣斑塊面積大于 3mm2。 染色后粥樣斑塊呈紅色 。 ? 3．主動脈內(nèi)膜 /中膜（ I/M） 厚度比值測定 從主動脈弓分叉處取材長約 3~4mm， 用 10%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋和切片， HE染色，采用。另取主動脈根部約 1 1mm2大小動脈組織迅速用 4%戊二醛（用 mmol/L磷酸緩沖液配制，濃度 ， pH=） 固定，留做透射電鏡標(biāo)本。 ? 2． 用高脂飼料喂養(yǎng) 3周后 ， 改為 15%雞蛋黃 +5%豬大油 +80%普通飼料 ， 不再加膽固醇 ， 繼續(xù)喂養(yǎng) 3周 ， 至此兔動脈粥樣硬化模型建立完成 。 高脂飼料配方： 15%雞蛋黃粉 +5%豬大油+%膽固醇 +普通飼料 %。 ? 3． 大鼠誘發(fā)模型 喂服 l%~4%膽固醇 、 10%豬油 、 %甲基硫氧嘧啶 、 86%~89%基礎(chǔ)飼料 ，7~10天 。 第二節(jié) 動脈粥樣硬化模型 ? 在動物飼料中加入過量的膽固醇和脂肪 ， 飼養(yǎng)一定時間后 ， 其主動脈及冠狀動脈內(nèi)逐漸形成粥樣硬化斑塊 。 ? 2． 形態(tài)學(xué)指標(biāo) 光鏡觀察軟腦膜和腦內(nèi)微血管擴(kuò)張 ， 紅細(xì)胞聚集成團(tuán)并形成微小血栓 。 ? 注意事項(xiàng)：每次注射時間不能少于10min， 否則動物會因循環(huán)容量驟增而發(fā)生心力衰竭死亡 ， 長期注射 HMWD容易引起動物嚴(yán)重貧血 、 血尿和腎功能衰竭而死亡 。 ? 2 ． 主要試劑 : 高分子右旋糖酐（ HMWD） ， 分子量 40~60萬 。 微循環(huán)直接與組織細(xì)胞接觸 ， 微循環(huán)功能的正常與否直接影響著組織細(xì)胞的正常功能 。第二章 常用動物模型 隨著分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的飛速發(fā)展，實(shí)驗(yàn)動物學(xué)的研究也不斷深入，逐漸形成了一門獨(dú)立的綜合性學(xué)科，對動物模型的認(rèn)識逐步加深。 第一節(jié) 微循環(huán)障礙模型 心血管系統(tǒng) （ 循環(huán)系統(tǒng) ） 維持血液的正常流動 ， 向全身各器官組織提供氧和營養(yǎng)物質(zhì) ， 同時帶走組織的代謝產(chǎn)物 。最佳時間為春 、 秋季節(jié) ， 室內(nèi)溫度一般保持在 25℃ 為宜 。 ? 二 、 實(shí)驗(yàn)方法 ? 兔性情溫順 ， 無需麻醉 ， 由一人固定 （ 大鼠用鼠籠固定 ） ， 另一人經(jīng)兔耳緣靜脈 （ 大鼠尾靜脈 ） 緩慢注射 5%的 HMWD， 5ml/kg，每日一次 ， 持續(xù) 10~20天 。 由于動物具有自我清除 HMWD的作用 ， 因而血液流變學(xué)改變只能維持 24~48h。 缺點(diǎn)是微循環(huán)障礙指標(biāo)維持時間只有 24~48h， 慢性實(shí)驗(yàn)需長時間連續(xù)注射 HMWD， 易造成動物重要器官功能衰竭而死亡 。 ? 2． 兔誘發(fā)模型 純種新西蘭白兔 ， 體重 2500g左右 ， 每天喂服膽固醇 ， 4個月可見動脈粥樣硬化斑塊 。 膽固醇由北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司提供 。 所有動物禁食 、 不禁水 12h， 稱量體重 ， 自耳中央動脈采血 ，測定基礎(chǔ)血清膽固醇 （ TC） 、 高密度脂蛋白（ HDLC） 及低密度脂蛋白 （ LDLC） 含量 ， 并計算 LDLC/HDLC。從主動脈根部至髂總動脈分叉處取出主動脈，將主動脈分叉處長約 3~4mm主動脈用 10%多聚甲醛固定，留作病理標(biāo)本。 ? 2． HDLC及 LDLC的測定 采用磷鎢酸 鎂法（ PTAMG法 ） 。 ? 4． 主動脈粥樣硬化斑塊的分級標(biāo)準(zhǔn) 自耳緣靜脈注射空氣 20ml， 氣栓處死動物 ， 取出主動脈 ， 由背側(cè)縱向剖開 ，直接用肉眼觀察粥樣斑塊形成情況 ， 或?qū)用}上的脂肪剔除 ， 用蘇丹 Ⅲ 染色后觀察 。 ? 1級 有明顯的奶油色凸出粥樣斑塊 ， 但面積小于 3mm2。 ? （ 2） 百分法：將剪取的主動脈剝?nèi)ネ饽さ闹窘M織 ，以 10%的福爾馬林固定 ， 蘇丹 Ⅲ 染色 。 ? Ⅲ 級：動脈粥樣硬化病變面積 16%~33%（ 1/3） 。 ? 5． 冠狀動脈病變的分級 取出心臟 ， 以 10%的福爾馬林固定 ， 將心臟橫切成 3塊 ， 每塊冰凍切片至少 2片 ， 用蘇丹 Ⅲ 及蘇木紫染色 ， 每張切片均觀察 10個動脈斷面 ， 并以下列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級 。 ? 1級 動脈內(nèi)膜粥樣斑塊占血管腔面積的 1/4。 第三節(jié) 高血壓模型 ? 高血壓病是全身小動脈痙攣引起血管外周阻力增加，血壓升高，并常伴有心、腦、腎和外周血管功能性或器質(zhì)性改變的全身性疾病。通過手術(shù)方式人為造成動物腎動脈狹窄，腎血流量銳減，由于腎嚴(yán)重缺血而引起腎素分泌增加，激活腎素 血管緊張素 醛固酮系統(tǒng)，導(dǎo)致全身小動脈收縮，鈉水潴留，循環(huán)血量增加，最終形成高血壓，稱為腎性高血壓。術(shù)后幾天血壓開始升高， 1~3月后血壓升至高峰，并可長期維持下去。 約 20天后 ， 30%的大鼠出現(xiàn)高血壓 。 另一類有心理成分也有軀體成分應(yīng)激 ，大鼠應(yīng)激性高血壓模型常采用噪聲和足底電擊的復(fù)合刺激 ， 每天上 、 下午各接受應(yīng)激一次 ， 每次 2h，20天左右可使大鼠形成高血壓 。 與此同時血管系統(tǒng)也隨之發(fā)生了強(qiáng)烈性變化 ， 而引起持續(xù)性高血壓 。也可使用在生理鹽水中添加界面活性劑和把 DOCA片劑包埋于動物皮下的方法，約經(jīng) 2周，動物血壓開始上升，經(jīng) 5~7周即可出現(xiàn)惡性高血壓病態(tài)。 ? 目前在 SHR的基礎(chǔ)上 ， 將易產(chǎn)生