20xx年醫(yī)學(xué)專題—流式細胞術(shù)樣品制備(完整)(文件)
【正文】 以二次消化。,第十九頁，共三十一頁。,第二十頁，共三十一頁。,㈠ 淋巴細胞的制備 ⒈取肝素抗凝血2.0ml，用生理鹽水2ml將全血稀釋至4ml。 ⒋用吸管將上層與中層之間的淋巴細胞吸出，收集到另一支離心管，用生理鹽水稀釋至10ml，離心洗滌2次，每次均以1500prm, 10分鐘，棄上清后即得到純度較高的淋巴細胞，但可有少量的單核細胞。 ⒉粒細胞的比重較淋巴細胞稍大，因此經(jīng)分離液分離后的粒細胞，分層于紅細胞之上，分離液的底部。,第二十三頁，共三十一頁。,第二十四頁，共三十一頁。 5.脫落下來的細胞移入離心管,離心沉淀1500prm,5分鐘,再以生理鹽水漂洗2－3 次,每次離心800prm,2分鐘,以去除碎片雜質(zhì)。,第二十六頁，共三十一頁。,第二十七頁，共三十一頁。 2.調(diào)整細胞數(shù)在1X106/ml,可進行標記染色上機,如不馬上檢測可用70% 的冰乙醇固定保存。 2.留取沉淀液1020ml，吸入試管內(nèi)，以生理鹽水洗三次，以1500prm離心沉淀5分鐘。 4.用300目篩網(wǎng)過濾后，以PBS洗去枸櫞酸緩沖液，離心沉淀去上清，加入70%乙醇固定備檢。xīn)沉淀2分鐘，棄上清。 2.取沉淀2040ml，離心沉淀，并以生理鹽水洗兩次，,第三十頁，共三十一頁。④收集細胞懸液，離心沉淀1000prm，5分鐘。各取40ml混合，分裝置冰箱保存，用時過濾既可。,。)70%乙醇固定備檢。)Hank180。ir243。 3.70%冷乙醇固定，置于冰箱備檢。,㈣ 內(nèi)鏡刷檢樣品單細胞懸液制備 1.將刷檢的毛刷放入10ml鹽水中洗脫，收集懸液進入試管,以1500prm離心(l237。ngzh236。,第二十八頁，共三十一頁。xīn)沉淀,再用生理鹽水洗滌2次,離心(l237。 ㈠ 宮頸脫落細胞懸液的制備 1.首先用生理鹽水沖洗宮頸表面的分泌物,以海棉輕拭宮頸表面,將海棉中吸附的脫落細胞洗脫到20ml生理鹽水中。 7.將細胞以70%乙醇固定,置04℃冰箱保存?zhèn)錂z。ngp237。 2.1640培養(yǎng)液10.0ml,放入培養(yǎng)瓶內(nèi),將稀釋血加入 培養(yǎng)液中,混勻,與培養(yǎng)瓶接觸面要大。 ⒋在吸取(xīqǔ)粒細胞的同時常附帶一些紅細胞，因此需將紅細胞去除，加入1.0ml低滲溶液，3040秒。,第二十二頁，共三十一頁。 ⒊離心2000prm，30分鐘，室溫1820℃，離心后可見(kěji224。)介紹幾種血細胞的分離制備方法。 消化時間不可過長，以免造成已釋放出的細胞核被消化掉。 ⑨制備好的單細胞懸液作涂片，AO染色在熒光顯微鏡下觀察，應(yīng)為完整細胞核，核發(fā)出黃綠色熒光。,⑥消化30分鐘后，立即加入(jiār249。 ④水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度(tī d249。,第十七頁，共三十一頁。)實驗?zāi)康倪x用最佳的細胞固定方法，以免由于固定劑的原因，造成FCM檢測結(jié)果的不穩(wěn)定。 酶學(xué)法對實體腫瘤的分散解聚是較理想的，但是會對所測化學(xué)成分造成不良影響，所以根據(jù)使用目的去選擇合適的單細胞懸液制備方法，才能獲得理想的樣品和更好的FCM結(jié)果。,實驗證實，用化學(xué)試劑處理組織導(dǎo)致細胞成活率降低，細胞產(chǎn)額較低，細胞碎片(su
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