【正文】 轉 抗蟲 基因水稻安全性研究 轉抗蟲基因 水稻 不僅 減輕 了 化學農藥造成的環(huán)境污染，還 可 以 提高水稻產量，降低農業(yè)生產成本，實現(xiàn)農業(yè)可持續(xù)發(fā)展 ， 因此， 具有廣闊的應用前景 。 由于轉單一抗蟲基因水稻，經過一段時間后，昆蟲就會對其產生耐受性。 Hosoyama 等 1995 年 將 巰 基蛋白酶抑制劑基因導入水稻， 得到轉基因植株表現(xiàn)出巰 基蛋白酶抑制劑活性 ，有一定抗蟲性 [72]。 其它 抗蟲基因水稻 除 Bt 基因 外，蛋白酶抑制劑基因，植物源凝集素基因 等植物來源的抗蟲基因和某些 動物 來 源的 抗蟲 基因也具有較好的抗蟲效果。日本科學家 Fujimoto 等 1993年 通過電激法將 修飾的 Bt 基因 CryI(A)b 轉入 粳稻 原生質體 中 ， 檢測 結果表明轉基因植株中 Bt 蛋白 總量占可溶性 蛋白 總量 的 ％， 說明 Bt 基因 在轉基因植株中 得到了 高效表達 [66]。 13 轉抗蟲 基因水稻 轉 Bt基因水稻 Bt 基因是從從蘇云金芽孢桿菌中分離克隆得到的一類 抗蟲基因，它通過產生殺蟲晶體蛋白起到抗蟲效果， 具有 殺蟲效果好，專一性強，對人 、 畜無毒性等優(yōu)點，成為 水稻轉 抗蟲 基因 的首選基因。 易自力等人 通過比較 3 種篩選劑的作用效果，結果表明 秈稻品種的篩選以 hyg B作為篩選劑 最適合 [46]。 孫建昌等研究發(fā)現(xiàn)在洗菌后愈傷組織 轉入 篩選培養(yǎng) 基 之前，對愈傷組織進行干燥處理，可以有效地降低篩選過程中農桿菌的過度生長，起到抑菌的作用，降低污染率 ，因此采取在 超凈工作臺上吹 2h 左右至愈傷組織干燥 來抑菌 [61]。目前常用的方法是用滅菌蒸餾水洗脫并在最后幾次洗脫時加入抗生素抑制 ，同時在篩選培養(yǎng)基中加入抗生素抑制 。 共培養(yǎng)環(huán)境和時間 王彩芬等認為 在 26℃ 共培養(yǎng) 2d 的抗性愈傷組織頻率最高， 若 時間太長 ， 農桿菌 12 難以抑制， 脫菌困難 [60]。 因此對愈傷組織進行適當?shù)睦^代和預培養(yǎng)，可增加胚性愈傷組織比例，提高轉化率?？梢?， 不同的培養(yǎng)材料對培養(yǎng)基中各種成分的需求不同 ， 在實驗過程中可以根據各種不同培養(yǎng)基成分的特點進行搭配以組合成新的培養(yǎng)基 來 獲得較為理想的培養(yǎng)效果。 培養(yǎng)基成分 培養(yǎng)基中 各種成分含量的不同對愈傷組織的生長至關重要，因此， 選擇恰當?shù)呐囵B(yǎng)基是 良好 愈傷組織 的 獲得， 農桿菌介導 遺傳轉化 的成功 與 轉基因 植 株 再生的基礎條件。 Hiei 等證明100μM的乙酰丁香酮是粳稻轉化的最佳濃度的關鍵 [34]。 因此，采用超毒力的農桿菌菌株和超雙元載體 ，能夠增強農桿 菌的侵染能力和 TDNA 的整合能力 ， 較好地 克服 了 包括水稻在內的單子葉植物對農桿菌敏感性差的問題。不同農桿菌菌株對水稻愈傷組織的轉化能力也是不同的， Hiei 等發(fā)現(xiàn) LBA4404 效果優(yōu)于 EHA101[33]；劉巧泉等，易自力等發(fā)現(xiàn) EHA105 轉化效果優(yōu)于LBA4404 和 AGL1 菌株 [44， 45]。 至此， 農桿菌介導的水稻遺傳轉化技術獲得突破性進展并 日益 成熟。 （ 5） Western 雜交， 是一種 將蛋白質電泳、印跡、免疫測定融為一體的特異蛋白質檢測方法， 能直接顯示目標基因在 轉化體中是否經過轉錄、翻譯，最終合成蛋白質而影響植株的性狀表現(xiàn) ，它是檢測目標基因在翻譯水平上的表達情況 。 轉基因 植 株的分子鑒定可以通過 以下 5 種方法進行： （ 1）報告基因的酶法檢測， 報告基因就是一種指示基因， 如 GFP 獨特的熒光特性 ， 用來 指示 是否轉入外源 基因。 （ 6）其他方法 朱禎 將人 α干擾素基因 應用轉化脂介導法 導入水稻原生質體中，獲得了轉基因植株 [39]；李寶健等運用電注射法將外源基因直接導入水稻種胚，獲得轉基因植株 [40]；楊劍波等人用低能粒子束介導法獲得轉基因水稻 [41]。 （ 5）花粉管通道法 此方法是將 外源 DNA 分子 在授粉后注射入 花粉管 ， 然后 9 沿著花粉管通道 進入胚囊，轉化 未成熟的 卵 細胞 ， 進而借助天然種胚系統(tǒng)形成轉基因種胚 。 （ 3） PEG 法 此法是利用 高濃度 的 PEG 具有極強的親水性， 能 使 DNA 大分子沉淀， 促進 水稻原生質體與 外源 DNA 相互 靠近 并 作用 ，促使原生質體 直接攝取外源 DNA。 目前已有大量的水稻品種 采用此 法 轉外源基因 獲得了成功。 農桿菌介導的遺傳轉化 獲得的轉基因植株目的基因拷貝數(shù)少， 不易發(fā)生染色體變異，后代性狀遺傳 也比較 穩(wěn)定 。 8 轉化方法 （ 1）農桿菌介導法 此方法 自 Zembryski 等利用農桿菌 介導法 轉化煙草獲得首例轉基因植株 后 [32]，逐漸得到推廣。水稻的幼胚與幼穗獲得的 愈傷組織雖然轉化效率很 高，但取材受季節(jié)和環(huán)境的限制， 現(xiàn)階段 應用較少。 在根癌農桿菌介導的 水稻 遺傳轉化中，所 用載體 大多數(shù) 為雙 TDNA 載體 ，其中一個 TDNA 含有目的基因，另一個 TDNA 含有標記基因或報告基因， 以便于 轉目的基因受體的篩選與檢測及 轉基因后代 選擇標記基因 的去除 。 目前常用的選擇標記基因主要有 潮霉素磷酸轉移基因 (hpt)、 新霉素磷 酸轉移酶基因 (nptⅡ )等 抗生素類 選擇標記 基因 和 抗除草劑 基因（ bar）等 。 外源基因整合到受體植物中能夠 高 效 表達的最重要的條件 之一就是要有一個強啟動子序列 。 抗蟲基因存在的主要問題及解決策略 雖然 在一定程度上， 抗蟲基因轉入植物 后， 改良了某些農藝性狀，減少了作物的蟲害，提高了產量，但是也存在一些的問題：（ 1）抗蟲基因的種類 雖然眾多，總體來說抗蟲譜比較廣泛，但 從 嚴格意義上來說， 每一種抗蟲基因殺蟲譜 卻相對狹 窄，如 Bt 基因種類很多，每一種 Bt 基因 都有一定 范圍 的抗蟲譜，所有種類的 Bt 基因 可以殺滅 多種害蟲，但是每 一種 Bt 基因只能殺滅一種或幾種害蟲，而且 經過一段時間以后，昆蟲會對某些特定的抗蟲基因 產生耐受性，抗蟲基因的抗性不會持久；（ 2）有些抗蟲基因的表達量較低，不能達到殺蟲所需要的濃度，如 CpTI 基因導入植物 后 ，只有遠高于 Bt 毒蛋白 的表達濃度才能起到殺蟲作用，但是它表達 濃度 的 提高很 可能 會 對植物產生 某些 負面影響；（ 3）某些抗蟲基因不僅抑制或殺死害蟲，對人 、 畜也有毒性，如 某些 植物凝集素除對 害蟲有較 強的抑制 或殺死 作用外，對人 、 畜也有較低毒性，如 果 將這種凝集素基因 轉入農作物 ， 則不會 被公眾所接受；（ 4） 其它種類的 抗蟲基因如 來 源于動物的抗蟲 基因 對害蟲 的 抗蟲機理仍不清楚，對它們的研究仍處于積極 探索中。另一類研究較多的是 蝎和蜘蛛產生的毒素，這些毒素能專一的作用于昆蟲而對哺乳動物 則 無害或毒性很低。 動物來源的抗蟲基因 在這一類基因中，研究的較多的是來 自哺乳動物 和煙草天蛾的蛋白酶抑制 5 劑基因。 轉植物凝集 素 基因 的農 作物雖然能夠抗蟲，但是有些對人也有毒害作用，然而雪花蓮外源凝集素 基因 （ GNA） [19]和豌豆外源凝集素 基因 （ Pea lectin） [20] 因為對人、畜不產生毒性或毒性很低， 已被 成功轉入煙草和馬鈴薯等多種作物中，結果表明抗蟲效果良好， 因此受到人們的重視 [21]。但是，蛋白酶抑制劑基因在 植物抗蟲基因工程中 也存在不足， 其 在轉基因植物中 表達量太低，不能滿足抗蟲 所 需要 的表達量 ，因此在實際應用中還有一定困難。在植物中 ，目前 發(fā)現(xiàn)的蛋白酶抑制劑主要有三類 :絲氨酸蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑 、巰基蛋白酶抑制劑 [11]。在同一基因型下根據限制性內切酶的酶譜和分子量的大小，又分為 a， b， c 等不同的基因亞型 [7]。 ICPs 與昆蟲腸道細胞表面受體相互作用的特異性決定了 Bt 毒蛋白的抗蟲譜。蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白（ Insecticide crystal proteins， ICPs）又稱 δ內毒素 ， 是一類在蘇云金芽孢桿菌芽孢形成期產生的具有特異殺蟲活性的晶體蛋白，其在伴孢晶體內以原毒素的形式存在 。通過基因工程手段 轉入外源抗蟲基因， 培育抗蟲新品種可從根本上解決問題， 而且對哺乳動物和一些有益昆蟲不產生毒害作用，也 不 會 造成環(huán)境污染， 在 生產上 具有廣闊的應用前景。 因此，減少病蟲危害是 降低生產成本、 提高水稻產量的一個重要途徑。據統(tǒng)計，到 2025 年水稻產量需增加60%才能滿足日益增長的人口需求 [2]。 R818 was only transformed into the gene of were 233 transgenic plants, but only 46 plants of them were transgenic plants identified by PCR and Hyg B solution. Key words: Indica rice。結果表明 Cry30Fa1 與Cry54Aa1 轉 R125 未獲得轉基因陽性植株； Cry54Aa1 轉 R818 也未獲得轉基因陽性植株； Cry30Fa1 轉 R818 共獲得 233 株轉基因再生植株，經過潮霉素溶液檢測和分子檢測，其中 46 株為含目的基因的陽性植株。結果表明 R125 與 R818的愈傷組織繼代 23 次，分化率最高；繼代培養(yǎng)基中加入 Vc 濃度為 40mg/L，能減少愈傷組織褐化率且對其分化能力無影響。因此，通過對農桿菌介導的水稻轉化體系的優(yōu)化提高轉化率十分必要。 秈稻是亞洲栽培稻的重要亞種，全世界水稻栽培品種中有 80%以上屬于秈稻，其組織培養(yǎng)研究具有重要意義。因此，通過培育自身能夠抵抗蟲害的水稻品種來防治水稻蟲害無疑是最經濟安全的有效策略。 I 畢業(yè)論文 農桿菌介導的水稻轉化體系的優(yōu)化 II 摘要 水稻是世界上最重要的糧食作物之一，為約 40%的人口提供了主要食糧。目前，我國控制水稻蟲害最主要的方法是使用化學殺蟲劑，但化學防治帶來一系列問題，如環(huán)境污染，生產成本提高和食用安全性降低等。因此，從自然界中分離克隆出更多、更有效的基因成為解決這些問題的方法之一。然而，水稻不同品種間遺傳差異性比較大，且轉化反應對水稻基因型依賴性強，從而增加了農桿菌介導的水稻遺傳轉化的復雜性和隨機性。 2. 通過對愈傷組織繼代次數(shù)與繼代培養(yǎng)基中加入抗壞血酸（ Vc）濃度的優(yōu) III 化，調整愈傷組織生長狀態(tài)，提高胚性愈傷組織數(shù)量。 4. 農桿菌介導法將外源基因 Cry30Fa1 與 Cry54Aa1 轉入三系恢復系 R125 與R818 中，通過 PCR 檢測與潮霉素溶液檢測轉基因植株。 Subculture media with 40 mg/L Vc could reduce the rate of callus browning with no effect on their differentiation capacity. 3. By drying callus after washing Agrobacterium and before differentiation, the system of Agrobacterium tumefaciens mediated transformation was improved. Results showed that after washing Agrobacterium and before regeneration the caulls were dried 2days on filter papers, differentiation speed was accelerated and differentiation rate was increased. 4. Agrobacterium tumefaciensmediated transformation of exogenous genes Cry30Fa1 and Cry54Aa1 into caulls of rice restorers R125 and R818, then identified gentic plants by PCR and Hyg B solution. As a result, R125 was no transgenic plants。 Agrobacterium tumefaciensmediated VI 縮寫詞 (Abbreviation) 縮寫名 英文名 中文名 6BA 6Benzylaminopurine 6芐基氨基嘌呤 AS Acetosyringone 乙酰丁香酮 2, 4 D 2,4Dichlorophenoxy acetic acid 2, 4二氯苯氧乙酸 bp Base pair 堿基對 Ti Timentin 替曼汀 Hyg Hygromycin B 潮霉素 B t Bacillus thuringiensis 蘇云金芽孢桿菌 NAA Naphthalene acetic acid 萘乙酸 OD Optical density 光密度 PCR Polymerase chain reaction 聚合酶鏈式反應 Rif Rifampicin 利福平 SDS