【正文】 low, causing some production value on a large varieties of transformation are still difficult to successfully transform or frequency low. Therefore, the study of high quality indica rice callus formation and plant regeneration ability of geic transformation rate is necessary. Agrobacterium tumefaciensmediated transformation has technique advantages including low copies, and is widely used in the study of insectresistant transgenic rice. However, the relatively large geic differences between different varieties of rice, and the transformation strong dependence on rice genotypes, increase plexity and randomness of the Agrobacterium tumefaciensmediated transformation in rice. Therefore, the optimization of Agrobacterium tumefaciensmediated rice transformation system to V improve transformation rates is necessary. This research has the following main areas of work: 1. Seqences of new Bt genes Cry30Fa1 and Cry54Aa1 that had been added cleavage site sequences at both ends, were sent to gene pany to synthesis. Then all of target gene fragments and middle cloning vector pUPROK were cut separately by two enzymes and connected to form middle carriers of the target gene fragments. Positive vectors were got by sequences identification, and were digested by endonuclease to separate target gene fragments. Then target gene fragments were inserted into pCDMARHyg vector to form eventual expression binary vectors pCDMARCry30Fa1Hyg and pCDMARCry54Aa1Hyg. All of positive plasmids were identified by digestion and sequencing. 2. By optimizing callus subculture time and different concentration of Ascorbic acid (Vc) in subculture media, callus growth state was adjusted and embryo callus were increased. Results showed that when R125 and R818 callus were subcultured 2 to 3 times, the differentiation rate was the highest。 Pestresistant。 同時(shí)， 水稻也是蟲(chóng)害最多的糧食作物之一，田間害蟲(chóng)種類達(dá) 624 種以上，每年 僅由于螟蟲(chóng)危害所造成的直接經(jīng)濟(jì)損失就達(dá) 億元，使用化學(xué)殺蟲(chóng)劑防治螟蟲(chóng)的費(fèi)用每年達(dá) 億元，所以每年由稻螟 蟲(chóng) 危害引起的總經(jīng)濟(jì)損失就能達(dá)到 億元 [3]。 化學(xué)農(nóng)藥的施用在減少蟲(chóng)害的同時(shí)還伴隨著一些副作用，如提高 生產(chǎn) 成本、污染 生態(tài) 環(huán)境、危害人體健康、 破壞生態(tài)系統(tǒng)、誘 導(dǎo)害蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性、 殺死害蟲(chóng)的天敵、 引起次要害蟲(chóng)的大發(fā)生等，從而使 化學(xué)農(nóng)藥控制蟲(chóng)害的方法在生產(chǎn)應(yīng)用受到了一定的限制。 抗蟲(chóng)基因的種類及特點(diǎn) 目前 我們 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并獲得了很多種抗蟲(chóng)基因， 這些抗蟲(chóng)基因 根據(jù) 來(lái)源進(jìn)行分類， 大體可以分為 以下 三類 ：第一類是從細(xì)菌如蘇云金芽孢桿菌中 分離得到的抗蟲(chóng)基因，主要是 Bt 毒蛋白基因；第二類是從植物中分離出來(lái)的基因，包括 2 蛋白酶抑制劑基因，外源凝集素基因，淀粉酶抑制劑基因等；第三類是從動(dòng)物體內(nèi)分離出來(lái) 的 毒素基因，如 蜘蛛毒素基因和蝎毒素基因 等 [4]。 （ 2） Bt 毒蛋白基因分類 由于蘇云金芽孢桿菌殺蟲(chóng)蛋白基因具有多樣性， Bt 毒蛋白的基因分類一直是細(xì)菌學(xué)家 們 爭(zhēng)論不休的問(wèn)題，直到 1975 年才正式列為一個(gè)獨(dú)立的種，種以下又根據(jù)鞭毛抗原的血清型和生理生化特征的不同分為不同的亞種，后來(lái)由于無(wú)鞭毛亞種的出現(xiàn)，又把營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的酯酶型作為輔助分類依據(jù) [6]。根據(jù)它們殺蟲(chóng)譜的范圍，可將 Bt 殺蟲(chóng)基因分成六大類，即 CryⅠ 、 CryⅡ 、 CryⅢ 、CryⅣ 、 CryⅤ 和 Cyt。 3 表 目前發(fā)現(xiàn)的一些 Bt 毒蛋白大體分類及殺蟲(chóng)譜 The general classification of Bt δendotoxin found currently and insecticidal spectrum 種類 毒蛋白名稱 殺蟲(chóng)范圍 CryⅠ CryIA(a) CryIA(b) CryIA(c) CryIB CryIB(b) CryIC CryID CryIE CryIF CryIG CryIX 鱗翅目 CryⅡ CryIIA CryIIB CryIIC 鱗翅目、雙翅目 CryⅢ CryⅢ A CryⅢ B CryⅢ B2 CryⅢ C CryⅢ D 鞘翅目 CryIV CryIVA CryIVB CryIVC CryIVD 雙翅目 CryV CryVA(a) CryVA(b) CryVB CryVC 鞘翅目、鱗翅目 Cyt CytA 雙翅目 蛋白酶抑制劑基因 蛋白酶抑制劑 (Proteinase Inhibitor， PI)是 植物本身起防御作用的 并且是自然界 含量最豐富的 蛋白質(zhì)種類之一，而且某些純化的蛋白酶抑制劑對(duì)昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)和發(fā)育具有明顯地抑制作用 [9]。目前已經(jīng)有 多種植物導(dǎo)入 了 絲氨酸 蛋白酶抑制劑基因 ， 其中豇豆胰蛋白酶抑 制劑（ CpTI）是 抗蟲(chóng)效果 最為有效的 絲氨酸 蛋白酶抑制劑，現(xiàn)已 有多種植物如 棉花 [13]、煙草 [14]、水稻 [15]等 導(dǎo)入了 CpTI 基因 ，獲得的轉(zhuǎn)基因植株 對(duì)鱗翅目和鞘翅目害蟲(chóng) 均具 有較好的抗蟲(chóng)效果。外源凝集素 對(duì)昆蟲(chóng)的抗蟲(chóng)機(jī)理 還 研究得 不十分清楚，一般認(rèn)為外源 凝集素 一旦被害蟲(chóng)攝食， 就會(huì)與 腸道圍食膜上的糖蛋白結(jié)合， 特異地識(shí)別并可逆地結(jié)合糖類復(fù)合物 ， 影響害蟲(chóng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的正常吸收 [17， 18]，從而 殺死害蟲(chóng)，達(dá)到抗蟲(chóng) 的目的。 其 抗蟲(chóng)機(jī)理是 аAI 能抑制昆蟲(chóng)消化道內(nèi)的 α淀粉酶 活性， 致使 昆蟲(chóng) 攝取食物中 的 淀粉進(jìn)入消化道后 不能 被 消化，導(dǎo)致害蟲(chóng) 不能正常的攝取能量， 從而 引起 非正常發(fā)育或死亡 [22]。如來(lái)自牛的蛋白酶抑制劑在體外抑制實(shí)驗(yàn)時(shí)均能顯著抑制昆蟲(chóng)中腸提取物的降解，然而，當(dāng)用轉(zhuǎn)入此基因的馬鈴薯飼喂害蟲(chóng)幼蟲(chóng)時(shí)，并未出現(xiàn)預(yù)期的抗蟲(chóng)效果，反而幼蟲(chóng)的體重超 過(guò)對(duì)照 [23]。 其它抗蟲(chóng)基因 膽固醇氧化酶 (Cholesterol Oxidase,cho)基因和營(yíng)養(yǎng)殺蟲(chóng)蛋白 (Vegetative insecticidal protein， vip)基因都是 來(lái)源于鏈 霉菌屬的第二代抗蟲(chóng)基因，它們都有較強(qiáng)的殺蟲(chóng)活性。 水稻基因工程育種的技術(shù)體系 基因工程育種研究 最早 始于 20世紀(jì) 70年代，是利用分子生物學(xué)和基因工程手段，有目的地 將外源基因 導(dǎo)入并整合到植物基因組中，通過(guò)外源基因在受體 植物 內(nèi)的表達(dá)和遺傳，或通過(guò)對(duì)內(nèi)源基因表達(dá)的調(diào)控，從而改良 受體植物 性狀的一種 技術(shù)。而終止子大多采用胭脂堿合成酶基因 (nos)的終止子 (nost)[27]。 7 選擇 轉(zhuǎn)化載體 在運(yùn)用 基因槍 法 ，電激法等對(duì) DNA 直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，不需要構(gòu)建特殊的載體，可直接將含目的基因的 質(zhì)粒 轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞 。目前， 用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的受體主要有下列 幾種： （ 1）愈傷組織 愈傷組織 是 目前 水稻遺傳轉(zhuǎn)化 應(yīng)用最為廣泛的轉(zhuǎn)化受體 ，用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的愈傷組織大多是由水稻成熟胚、幼胚、幼穗誘導(dǎo)得到的胚性愈 傷組織。 對(duì)水稻原生質(zhì)體可以 直接高效地進(jìn)行轉(zhuǎn)化， 而且 轉(zhuǎn)化率較高，但原生質(zhì)體 因培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，培養(yǎng)條件要求高， 分離 制備非常 困難 等原因 ， 現(xiàn)已很少應(yīng) 用 。 20 世紀(jì) 90 年代以后 ，人們對(duì)農(nóng)桿菌 的 侵 染機(jī)理做 了深入的研究， 對(duì)整個(gè) 轉(zhuǎn)化過(guò)程了解 清楚后 ，針對(duì)單子葉植物對(duì)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化 過(guò)程進(jìn)行了 適當(dāng)?shù)馗牧?， 使應(yīng)用此法對(duì) 水稻，玉米等 單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化 取得了成功。 （ 2）基因槍轉(zhuǎn)化法 Christou 等率先應(yīng)用基因槍法將 bar 基因轉(zhuǎn)入水稻幼胚，獲得可育的轉(zhuǎn)基因植株 [37]。 基因槍 法轉(zhuǎn)化 對(duì)細(xì)胞的損傷性大， 使 很 多 轉(zhuǎn)化 細(xì)胞死亡 。 （ 4）電激法 此方法是 利用瞬間高壓的電脈沖作用于受體細(xì)胞，使受體細(xì)胞表面產(chǎn)生暫 時(shí) 的孔隙，從而將 外源 DNA 分子導(dǎo)入 細(xì) 胞內(nèi)的一種方法，也稱為電穿孔法 。 由于該方法 可直接在田間進(jìn)行 操作，成本低， 易于 推廣 。 轉(zhuǎn)入 選擇標(biāo)記 基因的受體 一般表現(xiàn)為對(duì) 相應(yīng)的作用底物 的抗性， 如各種抗生素或除草劑 。 （ 3） Southern 雜交， 用特異 的 DNA 探針檢測(cè) 外源基因在植物中 的 整合位置及拷貝數(shù)等。 Chan 等 成功 獲得 了 可遺傳的農(nóng)桿菌 介導(dǎo)的 轉(zhuǎn)化水稻植株 [43]。因此， 對(duì) 整個(gè)遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化是獲得轉(zhuǎn)基因植株的重要條件。 在粳稻遺傳轉(zhuǎn)化中， Hiei 等人研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用超雙元載體比用雙元載體有更大的優(yōu)越性 [33]。 Stachel 等 1985 年首次從煙草葉片的傷口誘出液中分離出乙酰丁香酮（ AS）和羥基乙酰丁香酮 （ HOAS），并證明這些酚類物質(zhì)能激活 Ti 質(zhì)粒上 Vir 區(qū)基因的表達(dá) [48]。據(jù)此可以判斷， 不同水稻品種使用的最佳 AS 濃度存在差異。其中秈稻以MS[53]、 粳稻以 NB[54]作為主要的基本培養(yǎng)基。因?yàn)?細(xì)胞分裂間期染色體解螺旋，以染色質(zhì)形式存在， 且S 期是細(xì)胞 DNA 復(fù)制期，此時(shí)轉(zhuǎn)化有利于 TDNA 插入水稻基因組中 ，增加 遺傳 穩(wěn)定 性。不過(guò) ， 向殿 軍等 認(rèn)為 將 MS 培養(yǎng)基 和 YEB 培養(yǎng)基 按 3： 1 比例混合， 用于懸浮菌體 來(lái)侵染愈傷組織 ， 不但 能較好地控制 農(nóng)桿菌 生長(zhǎng) ，而且愈傷轉(zhuǎn)化率也要高于單獨(dú)使用其它培養(yǎng)基 [58]。王志成等認(rèn)為在 共培養(yǎng)的 培養(yǎng)基上覆 蓋 1 張干燥 無(wú)菌 濾紙 ,將愈傷組織放置在濾紙上以后再在愈傷組織周?chē)渭?12 滴 AAM 培養(yǎng)基的共培養(yǎng)方式為最佳 [56]。因此 篩選培養(yǎng)基中 合適 的 抗生素濃度是提高轉(zhuǎn)化效率的一個(gè)關(guān)鍵。 篩選標(biāo)記基因以及篩選劑的選擇 在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中，成功的篩選就是能有效地區(qū)分轉(zhuǎn)化成功與非成功的愈傷組織，并 產(chǎn)生較少的假陽(yáng)性植株。潮霉素能有效篩選水稻轉(zhuǎn)化與非轉(zhuǎn)化 的愈傷 組織，并且不易產(chǎn)生白化苗 [64]。 楊虹等 在 1989 年 通過(guò) 電融合技術(shù) 將 Bt 基因?qū)胨九_(tái)粳 209 的原生質(zhì)體中[65]。國(guó)際水稻所 (IRRI)Ghareyazi等 1997 年 報(bào)道了用基因槍法將 CryI(A)b 基因轉(zhuǎn)入 香粳品系 827， 檢測(cè)結(jié)果表明 Bt 毒蛋白 表達(dá)量相當(dāng)于可溶性蛋白的 ％， 而且轉(zhuǎn)基因 T2代植株 對(duì)一齡二化螟、三化螟 都 有高度抗性 [68]。中科院遺傳與發(fā)育生物 學(xué)研究所 將 修飾的CpTI 基因 (signalCpTIKEDL， sck)轉(zhuǎn)入水稻， 成功 轉(zhuǎn) sck 的 水稻表現(xiàn)出抗蟲(chóng)能力的提高 [70]。孫小芬等獲得了轉(zhuǎn) GNA 基因的純系水稻 ，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)褐飛虱有顯著的抑制作用 [74]。近年來(lái)，我國(guó)的 科學(xué)工作者在這一領(lǐng)域 也 進(jìn)行了較 多的驗(yàn)證和探索。 轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)基因水稻的食品安全性問(wèn)題 轉(zhuǎn)基因水稻中導(dǎo)入的外源基因通常來(lái)源于非近緣物種， 如細(xì)菌 、昆蟲(chóng) 等， 也可能是 人工合成的基因， 當(dāng)外源基因?qū)胨竞螅?除了對(duì)害蟲(chóng)產(chǎn)生作用外， 對(duì)人類健康和 15 環(huán)境也有可能 會(huì) 產(chǎn)生影響，對(duì)人類的安全存在潛在威脅。