大腸桿菌表達系統(tǒng)詳細表格(文件)
【正文】 的異源蛋白 ? 細胞周質內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素 28 第二十八頁，共三十六頁。 影響克隆基因在大腸桿菌中的表達效率因素 29 第二十九頁，共三十六頁。 a. 密碼子使用的偏愛性現(xiàn)象的規(guī)律性 幾乎在所有的簡并密碼子家族中，都有一個或兩個是優(yōu)先使用的偏愛性密碼子； 一些密碼子在各種不同基因中都是最常用的〔在編碼脯氨酸 4種同義密碼子， CCC是優(yōu)先使用的〕 高表達活性的基因比低表達活性的基因，呈現(xiàn)出較高程度的密碼子偏愛性 簡并密碼子的使用頻率，反響它們相應的 tRNA豐度。 33 第三十三頁，共三十六頁。 內(nèi)容總結 大腸桿菌表達系統(tǒng)。 。 T7噬箘體基因1編碼的 T7 RNA聚合酶選擇性的激活 T7噬箘體啟動子的轉錄。 34 第三十四頁，共三十六頁。 富含大腸桿菌罕用密碼子的外源真核基因，很難在大腸桿菌轉化子細胞中得到有效的表達。 a. 轉譯起始序列對表達效率的影響 SD序列后面的 4個堿基， T或 A時轉譯作用較高， C或 G時，下降 50%或 25%； 位于起始密碼子 AUG上游的密碼三聯(lián)體的堿基， CUU或 UAU時轉譯效率最有效， UUC、 UCA或AGG時下降 20倍； 位于起始密碼子 AUG下游的密碼子堿基組成，也影響轉譯的速率。它們之間的距離 (17bp)。 展 26 第二十六頁，共三十六頁。由于大腸桿菌細胞的分子環(huán)境和折疊機制等與真核細胞具有很大的差異 ,所以在應用大腸桿菌系統(tǒng)表達真核基因時有必要利用代謝工程或進化的方法改造細胞 ,解決大腸桿菌表達系統(tǒng)的局限性 ,提高產(chǎn)物的活性。 優(yōu)點： 1. 蛋白質的酶解作用程度低 2. 由于分泌到胞外的蛋白質種類少，因此目標蛋白容易純化 3. 增進了蛋白質的折疊作用 4. 蛋白質 N末端的結構真實 缺點： 1. 在大腸桿菌細胞中表達的外源真核蛋白質，通常是不會分泌到胞外培養(yǎng)基中去的 2. 由于分泌在胞外培養(yǎng)基中的蛋白質相當稀釋，因此目標蛋白質的純化過程比較復雜 24 第二十四頁，共三十六頁。 3.胞外表達： 使克隆在大腸桿菌細胞中表達的外源蛋白質，分泌到胞外培養(yǎng)基中進行別離純化。 ) 缺點： a. 折疊的蛋白質可能無法恢復其生物學活性 b. 蛋白質的終產(chǎn)量偏低 c. 蛋白質的生產(chǎn)本錢比較昂貴 d. 蛋白質種類多，因此純化比較復雜 21 第二十一頁，共三十六頁。 外源蛋白質在大腸桿菌細胞中的表達部位 1. 細胞質中表達 : 外源基因在大腸桿菌寄主細胞質中高效表達時，常會發(fā)生一種特殊的生理現(xiàn)象，形成包涵體。 4) 細菌片段可以通過親合色譜法輔助重組蛋白的提取。 2) 在融合蛋白中存在細菌肽
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