【正文】 機(jī)制上的共通性和特異性。具體分工和經(jīng)費(fèi)分配如下:課題1：多能干細(xì)胞向體細(xì)胞（包括神經(jīng)外胚層及心血管中胚層）分化模型及調(diào)控機(jī)制；負(fù)責(zé)人: 那潔, 副教授, 清華大學(xué)學(xué)術(shù)骨干: 沈沁，教授，清華大學(xué)張榮利，副教授, 北京大學(xué)預(yù)算經(jīng)費(fèi)： 24%課題2：多能干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化模型及調(diào)控機(jī)制；負(fù)責(zé)人: 韓春生, 研究員, 中科院動(dòng)物所學(xué)術(shù)骨干: 紀(jì)家葵，教授，清華大學(xué)預(yù)算經(jīng)費(fèi)： 24%課題3：表觀遺傳學(xué)調(diào)控在干細(xì)胞定向分化中的作用；負(fù)責(zé)人: 沈曉驊, 教授, 清華大學(xué)學(xué)術(shù)骨干: 劉曉玲，高級(jí)工程師，清華大學(xué)夏永靜，副教授, 清華大學(xué)預(yù)算經(jīng)費(fèi)： 25%課題4：轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在干細(xì)胞定向分化中的作用。紀(jì)家葵實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室將集中精力于將人的ESCs分化為PGCs，而韓春生實(shí)驗(yàn)室將集中力量獲得從多能性細(xì)胞來的SSCs。夏永靜副教授負(fù)責(zé)利用以上細(xì)胞和小鼠模型向心血管、神經(jīng)和生殖分化方面的研究?？蒲谐晒纬烧撐膶⒐_發(fā)表在知名雜志，關(guān)鍵技術(shù)將申報(bào)專利。重要的是，我們會(huì)做到真正的交流、合作、互補(bǔ)與共同發(fā)展。各組在自己的研究系統(tǒng)內(nèi)開展工作，不斷更新及共享數(shù)據(jù)庫，并探尋其它系統(tǒng)中與自己興趣相關(guān)的新的突破點(diǎn)。有的放矢地設(shè)計(jì)出提高分化效率和操控細(xì)胞命運(yùn)的最佳方案。（４）單細(xì)胞分析是本項(xiàng)目的特色之一。將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析與表觀遺傳組分析結(jié)合起來，我們將突破簡單的基因表達(dá)現(xiàn)象描述以及簡單的表觀遺傳組現(xiàn)象描述，利用最新的技術(shù)手段，研究多能性細(xì)胞分化發(fā)育過程中關(guān)鍵表觀遺傳密碼對(duì)于核心基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控機(jī)理。（６）我們是世界上率先使用RNA轉(zhuǎn)染技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞重編程的團(tuán)隊(duì)之一，在這項(xiàng)新技術(shù)的應(yīng)用上已積累了很多經(jīng)驗(yàn)。盡管科學(xué)家們已投入了大量的精力去嘗試各種生長因子和細(xì)胞因子的組合培養(yǎng)體系使多能干細(xì)胞在體外特定條件下分化為各種類型的細(xì)胞，但是分化方向很難控制，分化效率低，并且所得到的細(xì)胞往往缺乏正常的生理功能。　近幾年來，本項(xiàng)目的主要參加人員在多能干細(xì)胞的表觀遺傳機(jī)制（沈曉驊）、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控（湯富酬、汪陽明），與多能干細(xì)胞的定向分化（沈沁、那潔、紀(jì)家葵、韓春生）方面做了大量扎實(shí)的工作，已經(jīng)積累了豐富的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)和大量前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并獲得了多項(xiàng)具有國際影響的研究成果。預(yù)期目標(biāo) 建立人和小鼠多能干細(xì)胞向心血管、神經(jīng)和生殖細(xì)胞的分化、分離和培養(yǎng)系統(tǒng)； 建立若干組織特異性熒光蛋白報(bào)告體系； 獲得較為純化的心血管前體和組織細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）、神經(jīng)元、原始生殖細(xì)胞（PGCs）和精原干細(xì)胞（SSCs）和小鼠體內(nèi)分離的各胚層細(xì)胞； 完成RNAseq和microRNAseq測(cè)序文庫的構(gòu)建； 完成基因組敲入（knockin）質(zhì)粒載體的構(gòu)建，并得到內(nèi)源編碼bfPRC2 組分的陽性克隆ESCs；建立表達(dá)bfPRC2的分化細(xì)胞系，包括 EpiSCs (上胚層干細(xì)胞，僅對(duì)小鼠)、NPCs（神經(jīng)前體細(xì)胞）和NSCs （神經(jīng)干細(xì)胞）等。第三年研究計(jì)劃 對(duì)于差異表達(dá)的microRNA、ncRNA和蛋白因子,利用RNA過表達(dá)、RNAi、反義核酸以及基因敲除、免疫共沉淀和ChIP等技術(shù)，深入研究它們?cè)诙嗄芨杉?xì)胞向心血管、神經(jīng)和生殖細(xì)胞定向分化的功能； 研究Musashi、HuD、FMRP、PELOTA、DAZL和VASA等RNA結(jié)合蛋白在多能干細(xì)胞定向分化中的功能； 利用蛋白質(zhì)復(fù)合體純化和質(zhì)譜測(cè)序系統(tǒng)高通量篩選多能干細(xì)胞定向分化中與PCR2相互作用的蛋白質(zhì),； 利用bioRIPseq高通量篩選多能干細(xì)胞定向分化中與PCR2相互作用的非編碼RNA（ncRNA）； 利用microRNA缺失干細(xì)胞及相關(guān)分化表型篩選起重要調(diào)控作用的microRNA，并研究microRNA和轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于表觀遺傳修飾的直接調(diào)節(jié)機(jī)制。 利用蛋白coIP、RIP、RNAi及過表達(dá)，并結(jié)合分子、生化和細(xì)胞生物學(xué)等手段，驗(yàn)證組學(xué)分析篩選出的特定蛋白和ncRNA，研究它們對(duì)PRC2功能、H3K27me3以及多能干細(xì)胞增殖、分化的影響。 發(fā)表論文（IF5）30～50篇，力爭在國際頂尖學(xué)術(shù)期刊上（包括Cell、Nature和Science等）發(fā)表論文 3～6篇，并申報(bào)專利3～5項(xiàng)； 爭取以高水平完成結(jié)題驗(yàn)收工作。第五年研究計(jì)劃 構(gòu)建、整合體內(nèi)外、不同分化方向和階段及不同物種的組學(xué)數(shù)據(jù)，構(gòu)建涉及蛋白、RNA和DNA的互作與轉(zhuǎn)錄表達(dá)的四維表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并解析此網(wǎng)絡(luò)在多能干細(xì)胞分化過程中的動(dòng)態(tài)變化； 通過比較體內(nèi)外及不同分化方向的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的共通點(diǎn)和特異性，找到影響網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性和特異性的關(guān)鍵調(diào)控因子, 并研究關(guān)鍵調(diào)控因子在操控細(xì)胞命運(yùn)過程中的功能和作用； 利用RNA轉(zhuǎn)染技術(shù)、RNAi或小分子化合物干擾，通過操控主宰基因和非編碼RNA的表達(dá)水平，優(yōu)化多能干細(xì)胞向神經(jīng)、心血管和生殖細(xì)胞的定向分化； 研究表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在人和小鼠相應(yīng)細(xì)胞中的異同，揭示細(xì)胞分化的種屬進(jìn)化差異； 完善優(yōu)化人類多能干細(xì)胞向心血管、神經(jīng)和生殖細(xì)胞高效分化的體系；運(yùn)用動(dòng)物疾病模型對(duì)分化細(xì)胞進(jìn)行功能和安全評(píng)估。預(yù)期目標(biāo)構(gòu)建與PRC2相互作用的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（ncRNA和microRNA）；獲得若干影響多能干細(xì)胞向心血管、神經(jīng)和生殖細(xì)胞定向分化的調(diào)控因子（包括蛋白、microRNA和長鏈ncRNA）；闡明重要RNA結(jié)合蛋白和非編碼RNA在神經(jīng)和生殖分化中的作用；獲得一系列既帶有組織特異性熒光蛋白標(biāo)記，也同時(shí)表達(dá)帶標(biāo)記的PRC2組分或條件性microRNA全敲除系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠品系，為深入研究體內(nèi)胚胎發(fā)育過程中的分子和表觀遺傳調(diào)控提供實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。 建立體外分化的人類神經(jīng)干細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)體系；鑒定microRNA缺失干細(xì)胞在分化過程中的表型；構(gòu)建生物素－FLAG雙標(biāo)記PRC2的小鼠模型；建立生殖系統(tǒng)小鼠動(dòng)物模型研究平臺(tái)； 優(yōu)化biotinstreptavidin介導(dǎo)的蛋白提純及質(zhì)譜鑒定，和RNA免疫沉淀及高通量測(cè)序(bioRIPseq) 的實(shí)驗(yàn)方法；鑒定與PRC2相互作用染色質(zhì)區(qū)域；研究βcatenin在多能干細(xì)胞心血管組織分化過程中的結(jié)合蛋白；分析Foxg1和Jarid1B在多能干細(xì)胞分化過程中各時(shí)期的表達(dá)特性；通過RNAi和過表達(dá)研究Fo