【正文】 的種類及其理化性質(zhì)，經(jīng)綜合分析后找出成品中的藥效成妥或有效成分，作為成品或中間體指紋圖譜的研究對象，即分析檢測目標。各種色譜法是互補的，應(yīng)根據(jù)研究對象的實際需要和可能以及按照不同色譜技術(shù)的特點和優(yōu)勢而定，目的是保證方法的重現(xiàn)性和確能反映產(chǎn)品質(zhì)量的主要化學成分。一些難以檢測或采用上述方法得不到較理想的分離效果時，可采用 TLC或 CE。對于《中國藥典》收載的品種，從中醫(yī)的角度均可入藥，這種多基源藥材增加了色譜指紋圖譜研究的難度。通過對指紋圖譜的研究，可以對 “勾兌 ”過程進行指導(dǎo)。3． 3 原藥材、中間體及注射劑的預(yù)處理 在指紋圖譜研究過程中，供試品（原藥材、中間體及注射劑）溶液的制備過程不是關(guān)鍵性的技術(shù)問題，但操作煩瑣。中間體是原藥材經(jīng)過了多步處理而得，已經(jīng)濾過了大部分成分，只保留一小 部分有效組分，樣品制備時，可針對有效成分處理，并參照原藥材的制備方法。 我們以 HPLC法為例，闡述各影響因素及解決途徑。 在流動相中可加入磷酸、乙酸、三乙胺、二乙胺、正丁基溴化胺、十二烷基磺酸鈉等各種改性劑，或采用磷酸 磷酸氫二鈉 /磷酸二氫鈉、乙酸 乙酸鈉緩沖溶液，以達到改善色譜峰分離程度及改善峰形的目的。一個檢測波長下的色譜圖如不能達到控制質(zhì)量的目的，可建立多個檢測波長下的指紋圖譜。 色譜柱 不同廠家的色譜柱由于采用的填料不同，柱效相差較大。 同時要考慮填料的穩(wěn)定性和載樣量。研究發(fā)現(xiàn)，進樣量應(yīng)控制最高色譜峰的吸收值在 1000mAU以下適合。 國外一個成熟的指紋圖譜在形成法規(guī)之前，選擇世界各地有名的檢測機構(gòu)（分布于公司、醫(yī)院、大學等的獨立分析檢測室）進行復(fù)核，以保證所建立的指紋圖譜技術(shù)穩(wěn)定、可靠。 如：歐美植物藥領(lǐng)域普遍采用以人參皂苷 Rg1和人參皂苷 Re的峰面積作為鑒別中國人參、朝鮮人參、越南人參、西洋參及三七參的特征參數(shù)；淫羊藿中的 “五指峰 ”是《中國藥典》收載品種 Epimedium breuvicornum Maxim。 實現(xiàn)中藥指紋國庫券譜技術(shù)革新，除了研究中藥色譜指紋圖譜，還包括對照指紋圖譜及其技術(shù)參數(shù)的建立與指紋圖譜評價等過程。 目前多采用人工手動計算的方法或借助于 Microsoft Excell等應(yīng)用軟件計算這些參數(shù)，繁瑣，易出差錯，計算操作的過程了也不規(guī)范。 中藥色譜對照指紋圖譜的建立與中藥色譜指紋圖譜評價的原則 中藥指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)一旦建立，就可以作為 “標準 ”或 “對照 ”/“參照 ”，所起作用如同對照藥材，樣品的色譜圖譜可與對照指紋圖譜進行比較。 中藥色譜指紋圖譜在一定程度上與臨床療效的穩(wěn)定性及用藥安全性方面有相關(guān)性，因此對照指紋圖譜中所有色譜峰在樣品指紋圖譜中均應(yīng)體現(xiàn)且可追溯。 模糊性 在實際過程中由于受到各種因素的影響，樣品指紋圖譜中有可能出現(xiàn)個別色譜峰的增加 /減少，色譜峰圖譜行為可能發(fā)生改變，如峰形、峰寬、峰高發(fā)生變化及保留時間發(fā)生偏移等，不可機械性地通過色譜圖的疊加來評價反指紋色譜圖和相似。 當樣品間指紋特征相近時，該方法較好。 由于共有模式生成法綜合了所有樣品的指紋圖譜信息，因此 建議使用共有模式生成法 。能 比較應(yīng)在同一臺儀器平行進行測定，評價的結(jié)果可能陳致誤判或不同評價者得到不同的評價結(jié)果，建議通過計算機輔助指紋圖譜相似度評價軟件來進行。 參照國外實驗室的做法，現(xiàn)選擇積分面積相對比值（ RA）作為計算指紋圖譜相似度的變量。 相似度算法 （ 1） 相關(guān)系數(shù)算法 （ 2） 夾角余弦算法。 ② 從色譜軟件中均可采集到截片數(shù)據(jù)，即時間與電信號響應(yīng)值。 引用變量 根據(jù)《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》（暫行）之規(guī)定，與中藥指紋圖譜有關(guān)的技術(shù)參數(shù)如下： ① 保留時間（ RT）； ② 峰高（ height）； ③ 峰面積（ area）； ④ 峰面積比（ A%）； ⑤ 相對保留時間（ RRT）； ⑥ 積分面積相對比值（ RA）。 （ 2） 以樣品與對照樣品或 “標準圖譜 ”之間或不同批次樣品指紋圖譜之間總積分值作量化比較。當樣品間指紋特征差異較大時，典型指紋圖譜的選擇就很困難。對于難以把握的色譜峰，建議由軟件去進行判別評價，盡可能避免人為判別評價。為保證色譜指紋圖譜在整體上相似，在建立對照指紋圖譜時：① 應(yīng)盡可能包含所有具有指紋意義的特征峰，尤其是含量少面指紋意義顯著的色譜峰、指紋特征區(qū)、共有特征區(qū)；② 排除溶劑峰及其他可以追溯的雜質(zhì)峰，供試品的制備應(yīng)與工業(yè)生產(chǎn)相似，并盡可能采用流動相來溶解。 整體性 對照指紋圖譜的建與評價應(yīng)注意指紋特征的整體性。 有關(guān)技術(shù)參數(shù)的計算公式（ 1）相對保留時間 RRT RT（ i） RT（ S）RT（ i） 各色譜峰的保留時間RT（ i） 為各色譜峰的保留時間（ 2）積分相對比值 RA A（ i） RA= A（ s）A（ i） 為各色譜峰積分面積； A（ s） 為參考峰積分面積。按《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》（暫行），需對以上色譜數(shù)據(jù)進行處理，才能得到指紋圖譜技術(shù)參數(shù)。 指紋圖譜研究的建立、分析、比較、評價和校驗應(yīng)逐漸形成規(guī)范并取得共識。但大量的相對保留時間、共有峰峰面積比值等技術(shù)參數(shù)，不能直觀地用來鑒定、判別。 色譜條件的優(yōu)化 當一個指紋圖譜初步建立后，尚需進一步優(yōu)化。 6mm*250mm較適宜，其它特殊的色譜柱，如氨基柱、腈基柱、酸性柱、堿性柱等，可視研究對象的不同而采用。可供選擇的色譜柱填料型號： Zorbax、 Polaris、 Kromasil、MataSil、 Nucleosil。適宜的柱溫不僅影響色譜峰的分離效果，而且柱溫發(fā)生變化將導(dǎo)致色譜峰保留時間的遷移，技術(shù)參數(shù)的設(shè)置就失去了意義，因此，柱溫必須限定。對黃酮類、酚酸類成分可參考選擇乙膊 水 酸系統(tǒng)的流動相；對皂苷類成分可參考選擇乙腈 水系統(tǒng)的流動相，生物堿類成分可參考選擇乙腈 水 三乙胺等系統(tǒng)的流動相。反相高效液相，以乙腈 水系統(tǒng)比較適合梯度洗脫。 注射液中除少數(shù)品種添加助溶劑外，所含化學成分均具有較好的水溶解性能，面且研究生產(chǎn)工藝時考慮到色素、生物大分子等因素，生產(chǎn)過程中已通過微孔濾膜、脫色等操作，因此，樣品無需特殊處理，可直接分析檢測。原藥材所含的多種組分混雜在一起，樣品制備時，應(yīng)根據(jù)所含成分和物理化學性質(zhì)，通過萃取、沉淀、吸附或通過化學反應(yīng)，分離富集樣品。 根據(jù)《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》（暫行）之規(guī)定，原藥材、中間體及注射劑樣品至少應(yīng)收集 10批次。 我國藥材 GAP工程已起步，將有利于中藥注射