遺傳工程和轉(zhuǎn)基因技術(shù)(文件)
【正文】 活性的蛋白質(zhì)，這種現(xiàn)象叫 α 互補。通過呈色反應(yīng)即可初步識別可能帶有重組質(zhì)粒的菌落。 操作 1. 制備含氨芐青霉素的瓊脂糖平板。 4. 中止培養(yǎng)后，將平板置 4℃4h ，使藍色充分顯現(xiàn)，平皿上顯示藍色和白 色兩種菌落。這些脂質(zhì)體載體同培養(yǎng)的動物細胞一道溫育后，在細胞的提取物中，便可測定到內(nèi)酰胺酶的活性。其機制為陽離子脂質(zhì)，如 DOTMA, N[1(2,3二油酰氧 )丙基 ] –N, N, N三甲銨硫酸二甲脂和 DOPE,二油酰磷脂酰乙胺在與核酸混合后可以形成陽離子脂質(zhì)體從而將核酸包裹于其中的水相。 脂質(zhì)體載體法 陽離子型的脂質(zhì)體具有十分重要的作用。這種復(fù)合物可有效地被受體細胞捕獲，實現(xiàn)基因的高頻率轉(zhuǎn)移，這種方法為 DNA脂質(zhì)復(fù)合物轉(zhuǎn)染法。 3. 在 5ml聚丙乙烯試管中加入下列試劑 ml無血清的 MEM培養(yǎng)基 50 181。 4. 吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基。 8. 次日早晨，吸去舊培養(yǎng)基，并加入含 20%小牛血清的 MEM培養(yǎng)基。 2. 不必用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞。 TA克隆系統(tǒng)由 Invitrogen公司發(fā)展而來的商業(yè)性試劑盒，它用于PCR產(chǎn)物的克隆和測序。制備好的載體，其關(guān)鍵部分是帶有 3’ T突出端的線形分子。l 10 連接緩沖液 1181。l 12 ℃ 保溫 4～ 12小時。l mol/L β –巰基乙醇于細胞中并輕輕敲打使之混合。 ⑸ 42℃ 保溫 30秒，并把小管置于冰上 2分鐘。l XGal（ 40 mg/ml, 溶于 DMSO中）和 5181。l轉(zhuǎn)化混合物于分離平板上。 PCR產(chǎn)物的鑒別 PCR載體大小為 。從篩選出的克隆中提取質(zhì)粒，然后用下面的方法來區(qū)分插入片段是否為 PCR產(chǎn)物。 ⑵ 帶有 PCR引物的重組載體的 PCR擴增應(yīng)能產(chǎn)生同樣大小的產(chǎn)物。 這樣培育的動物稱為轉(zhuǎn)基因動物。 受精卵 → 移入寄養(yǎng)雌性動物的輸卵管內(nèi) → 子宮內(nèi)著床 → 發(fā)育成熟 轉(zhuǎn)基因小鼠， transgenic mice攜帶異種 DNA的小鼠 轉(zhuǎn)基因 transgene異種 DNA 轉(zhuǎn)基因家兔，豬，羊 轉(zhuǎn)入的基因是生長激素（ hGH） 觀察方法 ⑴ 檢測 hGH mRNA 在轉(zhuǎn)基因動物中的表達并 可測量 hGH的產(chǎn)生。 。 成功率低 2022個注射卵，只有一個卵產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。 雌性鼠（卵） 雄性鼠（精子） → 受精卵 → 從輸卵管洗出 → 用顯微注射法在前核內(nèi)注入感興趣的異體DNA → 把卵細胞移植于借腹懷孕的雌性小鼠 → 雌性小鼠產(chǎn)生多胎新生小鼠 → DNA分析鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠 顯微注射法 將克隆的異體基因注入受精卵 受精卵 2個前核， Pronucleu, 一個來自精子，一個來自卵細胞。 轉(zhuǎn)基因動物 把外源基因?qū)雱游锏氖芫眩賹⑦@一受精卵接種到寄養(yǎng)雌性動物， foster mother的子宮內(nèi)，使之發(fā)育繁殖。 Hind III 和 EcoR I對載體的酶切可以釋放 PCR 產(chǎn)物片段。載體也 包含有 M13正向引物和反向引物位點。 ⑽ 挑選白色的菌落進行質(zhì)粒電泳分析和限制性酶切分析， PCR擴增 以及測序。 ⑻ 鋪 25181。l預(yù)熱的 SOC培養(yǎng)基于小管中， 225rpm/min 37℃ 振蕩培 養(yǎng) 1小時。l連接混合物于細胞中，輕輕敲打。l。l PCR產(chǎn)物 1181。除非 PCR產(chǎn)物是多種系的，否則一般沒有必要純化 PCR產(chǎn)物。 TA克隆系統(tǒng)利用熱穩(wěn)定的 TaqDNA聚合酶在 DNA雙鏈分子的 3’ 末端加上一個腺苷酸。因為血清可以抑制核酸與脂質(zhì)體之間的相互作用。 注意問題 1. 目前許多分子生物學(xué)公司均生產(chǎn)不同的產(chǎn)品用于陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。 6. 將上述液體小心吸取 3 ml轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿上，注意不要破壞細胞層。l DNA或 RNA 5～ 19181。 操作方法 1. 在轉(zhuǎn)染之前，將細胞接種于 60mm 15mm培養(yǎng)皿上，培養(yǎng) 24小 時。存在于細胞質(zhì)中的 DNA脂質(zhì)復(fù)合物，仍然保持著完好的結(jié)構(gòu)，并有機會以同樣的方式與細胞核膜發(fā)生相互作用，并進入核內(nèi)。這一轉(zhuǎn)染方法比磷酸鈣法相比，其轉(zhuǎn)染效率要高 5到 100倍。這種由脂質(zhì)體介導(dǎo)的使外源 DNA導(dǎo)入細胞的方法，叫做脂質(zhì)體載體法，又叫做脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法。 脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染 脂質(zhì)體 一種人造的脂質(zhì)小泡，外周是脂雙層，內(nèi)部是水腔，它作載體可以把外源 DNA導(dǎo)入培養(yǎng)的哺乳動物細胞。置 37℃ 1h 直至所有液體消失。 試劑 Xgal (20mg/ml) 將 20mgXgal溶于 1ml二甲基甲酰胺中， 20℃ 避光存。當(dāng)外源 DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點后， 導(dǎo)致產(chǎn)生無 α 互補能力的氨基端片段。 α 互補篩選 適用于含有 β －半乳糖苷酶基因， LacZ的載體，如 pUC系列等， 其原理是載體含有 LacZ的調(diào)控序列和 N端 146個氨基酸的編碼信息。 2. 將 100μl 轉(zhuǎn)化菌液用無菌玻璃涂布器分別均勻涂布于含 Ap培養(yǎng)板 表面， 置 37℃ 培養(yǎng)箱 20min后倒置培養(yǎng) 12～ 16h。 重組質(zhì)粒的篩選 插入失活法篩選 原理 該法選用于含有２個以上選擇標志的載體，如 pBR322 帶有氨卞青霉素 和四環(huán)素抗性基因。 4. 取 100μl 涂布于篩選平板上（加抗菌素），對照菌涂布于另一篩選平板。貯存 1224h可增加轉(zhuǎn)化效率，超 過 24h效率下降。 10ml預(yù)冷的 ，冰浴 15min。 2. 從平板上挑取單菌落接種于 1ml LB液體培養(yǎng)基中， 37176。將對數(shù)生長期的細菌經(jīng)理化方法處理后， 細胞膜的通透性發(fā)生暫時性改變，成為能允許外源 DNA分子進入的感受態(tài)細胞。 （ 2μlTE 來自
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