【正文】 棉織物生物前處理工藝36 高產(chǎn)菌株選育 產(chǎn)酶微生物篩選 菌株鑒定和遺傳改造 分子克隆和工程菌構(gòu)建 發(fā)酵過程研究 酶的分離與純化 培養(yǎng)基和條件確定 發(fā)酵過程優(yōu)化策略 過程放大和工業(yè)化 分段控制 流加發(fā)酵 低成本 放大技術(shù) 分離與純化方法 酶的基本性質(zhì) 工業(yè)化提取技術(shù) 誘導(dǎo)脅迫 舉例 3： 染整關(guān)鍵酶制劑的發(fā)酵與應(yīng)用技術(shù) 37 酶制劑應(yīng)用 酶應(yīng)用特性和作用機(jī)理 復(fù)合酶和酶組分復(fù)配 過程模擬和最佳條件 應(yīng)用效果評價 應(yīng)用效果比較研究 經(jīng)濟(jì)學(xué)評價 環(huán)境效益分析 舉例 3： 染整關(guān)鍵酶制劑的發(fā)酵與應(yīng)用技術(shù) 38 野生菌篩選與發(fā)酵 提取高純度天然蛋白 電泳 主要斑點 N端測序 或肽指紋術(shù)分析 N端序列 /肽段分 子量數(shù)據(jù)庫查詢 獲得基因 N端測序 設(shè)計核苷酸探針雜交 獲得基因 生物數(shù)據(jù)庫查詢 同源序列 保守序列分析 設(shè)計引物擴(kuò)增 相關(guān)序列片斷 獲得基因 若出發(fā)菌基因組序列為已知 若出發(fā)菌基因組序列未知 Thermobifida fusca 角質(zhì)酶 角質(zhì)酶高產(chǎn)菌的構(gòu)建 細(xì)菌來源角質(zhì)酶編碼基因目前在國內(nèi)外未有報道 酶制劑基因鑒定流程 舉例 3： 染整關(guān)鍵酶制劑的發(fā)酵與應(yīng)用技術(shù) 39 0200400600800100012000 10 20 30 40 50 60f ra c t i o n N o . (4 m L / t u b e )protein (ug/mL)cutinase activity (u/mL)0510152025(NH4)2SO4 (%)proteincutinase activity(NH4)2SO4 02004006008000 10 20 30 40f ra c t i o n N o . (4 m L / t u b e )protein (ug/mL)cutinase activity (u/mL)00 . 20 . 40 . 60 . 811 . 2NaCl (mol/L)proteincutinase activityNaClPurification step Total protein (mg) Total activity (U) Specific activity (U/mg) Purification fold Yield (%) Crude enzyme 12294 1 100 (NH4)2SO4 fractionation Phenyl HP Sepharose FF DEAE Sepharose FF Table I Summary of purification of wildtype cutinase from T. fusca 天然嗜熱子囊菌角質(zhì)酶的純化 通過硫酸銨沉淀、疏水色譜、陰離子交換色譜從嗜熱子囊菌發(fā)酵液中分離純化得到電泳純天然角質(zhì)酶 角質(zhì)酶高產(chǎn)菌的構(gòu)建 舉例 3： 染整關(guān)鍵酶制劑的發(fā)酵與應(yīng)用技術(shù) 40 肽指紋圖譜鑒定角質(zhì)酶基因 對電泳純天然角質(zhì)酶進(jìn)行肽指紋圖譜分析，通過數(shù)據(jù)庫比對，得到角質(zhì)酶的編碼基因(Tfu_0883) 角質(zhì)酶高產(chǎn)菌的構(gòu)建 舉例 3： 染整關(guān)鍵酶制劑的發(fā)酵與應(yīng)用技術(shù) 41 T f u 0 8 8 3 / p E T 2 0 b ( + )4 5 5 8 b pb l a (A p ) s e q u e n c eC u t i n a s eH i s t a gT 7 p r o m o t e rC o l E 1 p B R 3 2 2 o r i g i nf 1 o r i g i nT 7 t e r m i n a t o rp e l B s e q u e n c eB a m H I ( 1 9 9 )N c o I ( 1 0 6 3 )Tfu_0883的克隆、表達(dá)和純化 kDa1 2 3通過基因工程手段使角質(zhì)酶基因在大腸桿菌中高效表達(dá)，工程菌發(fā)酵液酶活達(dá) 180 U/mL，是野生菌產(chǎn)酶的 。 利用 代謝通量分析方法， 計算 得出胞內(nèi) 各條代謝途徑的通量變化 。1 發(fā)酵工程的研究狀況和進(jìn)展 陳 堅 江南大學(xué) 2 發(fā)酵工程的研究狀況 3 生物質(zhì)原料 化學(xué)品 － 精細(xì)化學(xué)品 －大宗化學(xué)品 －食品添加劑 －生物塑料 －溶劑 －酚類 －粘合劑 －脂肪酸 －碳黑、顏料 －燃料、香料、墨水 －洗滌劑 生物能源 － 生物酒精 －生物柴油 －甲醇 －氫氣 －沼氣 工業(yè)生物技術(shù)主要部分 發(fā)酵工程 4 發(fā)酵：生物 反應(yīng)過程 上游 加工過程 加工過程 下游 成本經(jīng)濟(jì)學(xué) 原料 的生物 具有 應(yīng)用價值 目的產(chǎn)物 大規(guī)模 工藝開發(fā) 傳統(tǒng)誘變、分子生物學(xué)、組學(xué) 發(fā)酵工程 廣義的概念：生物學(xué) (微生物學(xué)、生物化學(xué) )和工程學(xué) (化學(xué)工程 )結(jié)合 t 1 2 3 E q s / h 1 t / h 0 0 10 20 30 40 50 60 1 2 3 F q p / h 0 m / h 1 1 2 3 1 D 狹義的發(fā)酵概念：微生物培養(yǎng)和代謝過程 微生物生長 底物消耗 產(chǎn)物生成 5 獲得應(yīng)用價值的微生物 反應(yīng)器及過程放大 發(fā)酵過程優(yōu)化和控制 發(fā)酵工程研究 發(fā)酵產(chǎn)物分離提取 6 發(fā)酵工程的關(guān)鍵問題和工程意義 微生物能夠積累最大目的產(chǎn)物 (產(chǎn)量 )的 條件 是什么？ 高產(chǎn)量 ? 便于產(chǎn)品分離提取 關(guān)鍵問題 1 工程意義 1 相關(guān)： 微生物生理、遺傳特性和營養(yǎng)、環(huán)境因素 7 底物最多被微生物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物(轉(zhuǎn)化率 )的 條件 是什么？ 糧食原料為底物 ? 高轉(zhuǎn)化率 ? 降低原料成本 關(guān)鍵問題 2 工程意義 2 相關(guān)： 微生物代謝途徑和過程條件 發(fā)酵工程的關(guān)鍵問題和工程意義 8 微生物最快速度發(fā)酵生產(chǎn)目的產(chǎn)物的 條件 是什么？ 分批操作為主 ? 高生產(chǎn)強(qiáng)度 ? 縮短生產(chǎn)周期 工程意義 3 關(guān)鍵問題 3 相關(guān)： 微生物反應(yīng)動力學(xué)和系統(tǒng)優(yōu)化 發(fā)酵工程的關(guān)鍵問題和工程意義 9 條件確定 過程優(yōu)化 初始條件 過程分析 過程強(qiáng)化 發(fā)酵優(yōu)化的研究思想：發(fā)酵是一個過程 10 基于細(xì)胞表觀特性進(jìn)行優(yōu)化 0 4 8 12 16 t / h d (DCW) / (g/L) A 0 20 40 60 80 100 120 140 t / h r (Glucose) / (g/L) B 0 20 40 60 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80 t / h r (Pyruvate) / (g/L) C 基于細(xì)胞內(nèi)部分析進(jìn)行優(yōu)化 高產(chǎn)量 高底物轉(zhuǎn)化率 高生產(chǎn)強(qiáng)度 優(yōu)化策略 在理論和技術(shù)上有突破 ,在工業(yè)生產(chǎn)中能廣泛應(yīng)用 顯著提高發(fā)酵過程的經(jīng)濟(jì)性和科學(xué)性 研究方法 11 1基于微生物反應(yīng)原理的培養(yǎng)環(huán)境優(yōu)化技術(shù) 優(yōu)化 微生物生長的物理和化學(xué)環(huán)境 保證 微生物生長處于最適條件 基本思想 奠定基礎(chǔ) 基于 底物運(yùn)輸、生化反應(yīng)、產(chǎn)物排出 確定 不同環(huán)境條件對微生物生長和代謝產(chǎn)物分布的影響 Prod. Distribution 發(fā)酵優(yōu)化 12 ● 培養(yǎng)基組成的優(yōu)化技術(shù) ● 發(fā)酵環(huán)境條件的優(yōu)化技術(shù) ● 確定培養(yǎng)基組分的最小用量，避免底物的過量或不足 ● 減少副產(chǎn)物的形成，使底物轉(zhuǎn)化率明顯提高 ● 對關(guān)鍵物質(zhì)的濃度及其供給方式進(jìn)行優(yōu)化，使目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量明顯提高 ● 分析不同環(huán)境條件下微生物的生理學(xué) 目的 內(nèi)容 13 2基于微生物代謝特性的分階段培養(yǎng)技術(shù) 研究思想 控制環(huán)境條件在最適合細(xì)胞生長或最適合產(chǎn)物合成的水平 。 發(fā)酵優(yōu)化 18 分析 不同發(fā)酵產(chǎn)品合成途徑中 主要代謝節(jié)點的性質(zhì) ，結(jié)合發(fā)酵過程中胞內(nèi)能量代謝情況， 提出 一系列發(fā)酵優(yōu)化策略 。 C uti n h y dr o l y s i s pr o du ct s F . s o l a ni cu t i n a s e hy d r o l y s i s A era ( % ) T . fus ca cu t i n a s e (T