基因重組-生物合成概念(文件)
【正文】 能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器（主要指線粒體和葉綠體）中和細(xì)菌細(xì)胞擬核區(qū)以外的環(huán)狀脫氧核糖核酸(DNA)分子。質(zhì)粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四環(huán)素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，大致上可以把質(zhì)粒分成大小兩類：較大一類的相對(duì)分子質(zhì)量是40106以上，較小一類的相對(duì)分子質(zhì)量是10106以下(少數(shù)質(zhì)粒的相對(duì)分子質(zhì)量介于兩者之間)。如較早的質(zhì)粒pBR322即屬于松弛型質(zhì)粒，要經(jīng)過(guò)氯霉素處理才能達(dá)到更高拷貝數(shù)?！ ≡诨蚬こ讨?，常用人工構(gòu)建的質(zhì)粒作為載體。如果將DNA片段插入EcoRI切點(diǎn)，不會(huì)影響兩個(gè)抗生素基因的表達(dá)。pSC101與pBR322相似，只是沒(méi)有抗氨芐青霉素基因和PstI切點(diǎn)。這種質(zhì)粒常含有抗生素抗性基因，例如，卡那霉素抗性基因。3種限制酶即ScaI、PvuI和PstI的識(shí)別位點(diǎn)位于氨芐青霉素抗性基因內(nèi)，在這些位點(diǎn)插入外源DNA則會(huì)導(dǎo)致ampr基因的失活。標(biāo)記基因往往可以賦予宿主細(xì)胞一種新的表型，這種轉(zhuǎn)化細(xì)胞可明顯地區(qū)別于非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。很顯然，既要指示外源DNA是否進(jìn)入了宿主細(xì)胞，又要指示載體DNA分子中是否插入了外源DNA片段，那么這種載體必須至少具有兩個(gè)標(biāo)記基因。 此后我們兵分兩路：一路把pBR313的PstI位點(diǎn)除去，使之成為ampstetr表型的pBR318質(zhì)粒； 5；另一路把pBR313的EcoRII的位點(diǎn)切除，使之成為amprtets表形的pBR320質(zhì)粒?！ ⑺救~綠體的DNA，用EcoRI核酸限制性內(nèi)切酶消化之后，放入含有溴化乙錠的低熔點(diǎn)（LMP）的1%瓊脂糖凝膠中作電泳分離。用Ampr轉(zhuǎn)化子菌落與32P放射性標(biāo)記的玉米psbA DNA 探針作菌落雜交，可以分離出其中的陽(yáng)性克隆體。由于有了lac操縱子的控制，重組基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)就變得比較容易了?！ ±胮BR322作為載體重組人體的抑生長(zhǎng)激素也是一個(gè)經(jīng)常提到的應(yīng)用例子。然后，將混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌5346菌株，培養(yǎng)在氨芐青霉素選擇平板上，形成Ampr轉(zhuǎn)化子菌落群體?！ BR322的應(yīng)用 了解了pBR322的結(jié)構(gòu)和它的構(gòu)建過(guò)程之后，我們來(lái)看pBR322在基因工程中的應(yīng)用。 pBR322質(zhì)粒載體的構(gòu)建 pBR322質(zhì)粒載體的構(gòu)建過(guò)程可簡(jiǎn)單地概括如下： 由于pBR322質(zhì)粒的親本之一是pMB1質(zhì)粒，故首先以pMB1為基礎(chǔ)，引入Rldrd19質(zhì)粒的Tn3易位子，； pMB3的分子量顯然使得它不適合作為載體，所以要通過(guò)在EcoRI活性條件下的消化讓它大部分的無(wú)用片段失去，留下來(lái)的小片段的DNA的黏性末端連接起來(lái)后就形成了pMB8質(zhì)粒（）； 此時(shí)，另外一種pSC101質(zhì)粒在EcoRI活性條件下消化產(chǎn)生了含有tetr抗性的DNA片斷
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