卵丘細(xì)胞對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟影響的設(shè)計(jì)(文件)
【正文】 丘細(xì)胞對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響獲取高質(zhì)量的體外成熟卵母細(xì)胞是成功進(jìn)行人類體外受精、動(dòng)物胚胎生產(chǎn)和克隆的關(guān)鍵。所以，繼續(xù)深入認(rèn)識(shí)卵母細(xì)胞的成熟規(guī)律、改善體外成熟培養(yǎng)環(huán)境、建立一種完善的卵母細(xì)胞體外成熟系統(tǒng)是當(dāng)前胚胎工程研究的重要內(nèi)容之一。 卵巢豬卵巢采集自河北省秦皇島市海濱區(qū)新店子屠宰場(chǎng)。吸卵液為TCM199+25 mmol/L HEPES+10 μg/mL肝素+ g/L BSA。C級(jí)：裸卵或卵丘細(xì)胞雖為1～2層或多層，但是不完整，部分裸露。成熟培養(yǎng)條件39℃ ,5%的CO2與飽和濕度，二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22～24 h。 根據(jù)包裹卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞的完整性分為3組:A組，有3層以上卵丘細(xì)胞緊密包圍的卵母細(xì)胞復(fù)合體記為(COCs)；B組，有3層卵丘細(xì)胞包圍的卵母細(xì)胞記為(COCs)；C組，有1～2層卵丘細(xì)胞包圍的裸露卵母細(xì)胞記為(NOs)，3組分別放于相同且適宜條件下培養(yǎng)。Antezak等和Goud等提出卵泡液和卵丘細(xì)胞層可儲(chǔ)存和釋放某些生長(zhǎng)因子和特定蛋白，這些因子和蛋白在卵母細(xì)胞的成熟與胚胎發(fā)育過(guò)程中按一定順序或選擇性地發(fā)揮調(diào)節(jié)胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的作護(hù)包裹在卵母細(xì)胞外的卵丘細(xì)胞層，以提高卵母細(xì)胞的體外成熟及后期胚胎發(fā)育的潛力。本研究結(jié)果表明，包裹卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞層的存在與其層數(shù)對(duì)卵母細(xì)胞的體外成熟和孤雌激活后胚胎發(fā)育的能力具有重要作用。在課程設(shè)計(jì)的過(guò)程中，過(guò)的充實(shí)而又緊張：查閱資料、文獻(xiàn)，確定自己的設(shè)計(jì)方案，查閱相關(guān)資料和課程設(shè)計(jì)報(bào)告的撰寫。參考文獻(xiàn)[1] 陳大元. 受精生物學(xué)[M]. 北京科學(xué)出版社, 2000,51: 147148.[2] 王海, 曾申明, 朱士恩. 培養(yǎng)介質(zhì)、卵丘細(xì)胞和卵泡直徑對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響[J]. 中國(guó)畜牧雜志, 2002, 38: 1516.[3] 錢云, 丁家桐, 劉紅林. 卵母細(xì)胞成熟的形態(tài)學(xué)特征及其調(diào)控[J]. 國(guó)外畜牧科技, 2001, 26: 2630.[4] 孫興參, 岳奎忠, 馬所峰. 豬卵丘擴(kuò)展與卵母細(xì)胞核成熟關(guān)系的研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2002, 35: 8588.[5] 張?jiān)粕? 石國(guó)慶. 影響哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞體外成熟的因素[期刊論文]貴州畜牧獸醫(yī), 2005, 27: 6669.[6] 李俊, 田永祥, 曹斌云. 影響豬卵母細(xì)胞體外成熟的因素[期刊論文]動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué), 2004, 10: 57.[7] 張曉華, 朱增娟, 袁水橋. 卵丘細(xì)胞在卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)過(guò)程中的作用[J]. 黃牛雜志, 2003, 23: 1012.[8] 葉華虎, 魏泓, 陳俊穎. 豬卵母細(xì)胞在不同培養(yǎng)液中成熟后的發(fā)育細(xì)胞體外成熟的影響[J]. 中國(guó)畜牧雜志, 2002, 38: 1517. [9] 曾申明, 朱士恩, 余文莉. 卵泡直徑和卵丘細(xì)胞對(duì)牛卵母細(xì)胞體外受精后發(fā)育潛力的影響, 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2000, 44: 24.[10] 郭憲, 陳學(xué)進(jìn), 葉榮. 牛卵泡卵母細(xì)胞體外成熟的研究[J]. 中國(guó)草食動(dòng)物, 2004, 24: 35.[11] 李榮鳳, 薛曉先, 劉哲. 牛卵母細(xì)胞皮層顆粒熒光染色法成熟鑒定[G]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2000, 31: 203210. [12] 孫興參, 岳奎忠, 馬所峰. 豬卵丘擴(kuò)展與卵母細(xì)胞核成熟關(guān)系的研究[期刊論文]中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2002, 11: 109112.[13] 文國(guó)藝, 黎宗強(qiáng), 陳自洪. 影響豬卵母細(xì)胞體外成熟的一些物理性因素 [期刊論文] 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2003, 06: 8890.[14] 馬緒榮, 蘇德模. 藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)手冊(cè)[M]. 北京: 科學(xué)出版社出版, 2001, 78: 229267.[15] 張莉, 馮書堂. 影響豬卵母細(xì)胞體外成熟的相關(guān)因素[J]. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2003, 08: 6061.[16] 項(xiàng)智鋒, 李艷, 王清華. 豬卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)研究進(jìn)展[期刊論文]安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2006, 21: 7680.[17] 徐永華. 動(dòng)物細(xì)胞工程[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2003, 45: 5558.[18] 劉酷, 李榮鳳. 體外培養(yǎng)綿羊卵母細(xì)胞核質(zhì)成熟的研究[J]. 內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2000, 3l: 101106. 17。整個(gè)的課程設(shè)計(jì)其實(shí)就是一個(gè)學(xué)習(xí)的過(guò)程，一個(gè)能力提高的過(guò)程，它會(huì)激勵(lì)我們?cè)诮窈蟮膶W(xué)習(xí)中，主動(dòng)去探討和學(xué)習(xí)。本次課程設(shè)計(jì)我選的題目是《卵丘細(xì)胞對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響》，回想起這些天緊張而又充實(shí)，正如趙老師說(shuō)的，此次設(shè)計(jì)時(shí)間緊任務(wù)重。劉酷等根據(jù)卵母細(xì)胞周圍卵丘細(xì)胞層數(shù)對(duì)綿羊進(jìn)行分類成熟培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)卵丘細(xì)胞包裹3層以上和包裹13層疏松卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞成熟率分別為82．4％和80．6％，其試驗(yàn)結(jié)果與本試驗(yàn)卵母細(xì)胞體外成熟結(jié)果基本一致，這在一定程度上說(shuō)明卵丘細(xì)胞層包裹程度對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟后體外成熟率并沒有顯著的影響。本研究中將包裹5層以上卵丘細(xì)胞的COCs經(jīng)機(jī)械脫除卵丘細(xì)胞層后，其體外成熟與孤雌胚胎發(fā)育能力顯著低于正常的COCs，這與Geshi等試驗(yàn)結(jié)果類同。成熟24 h時(shí)，將各組卵丘一卵母細(xì)胞復(fù)合體移入含O．25％透明質(zhì)酸酶的M199(Sigma，M4530)中，移液槍輕輕吹打移除卵丘細(xì)胞，體視鏡下用玻璃針撥動(dòng)卵母細(xì)胞檢查第一極體排出的情況(第一極體排出作為卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志)，并記錄各組成熟卵母細(xì)胞數(shù)及成熟率。每個(gè)液滴50μL并覆蓋石蠟油，每滴放COCs10~15枚。 豬卵母細(xì)胞的分級(jí)收集的未成熟豬卵母細(xì)胞以卵丘細(xì)胞層數(shù)為準(zhǔn)分為三級(jí)：A級(jí)：卵丘細(xì)胞在3層或3層以上。 試驗(yàn)用的儀器儀器廠商型號(hào)體式顯微鏡日本NikonSMZ熒光顯微鏡日本NikonE600全自動(dòng)高壓消毒鍋日本YamatoSM51CO2培養(yǎng)箱美國(guó) BINDER低溫臺(tái)式高速離心機(jī)德國(guó) Eppendorf自動(dòng)數(shù)字天平ADEK120A液氮罐TaylarWharton藥品廠商TCM199GIBCOHepesSIGMAFCSSIGMAFSH寧波市激素制品有限公司LH寧波市激素制品有限公司PFF自制青霉素大連美羅大藥廠鏈霉素大連美羅大藥廠蔗糖上海生物優(yōu)先公司GlySIGMADMSOSIGMA北京耀北生物技術(shù)公司四孔板北京耀北生物技術(shù)公司(COCs)的收集從屠宰場(chǎng)收集卵巢后，放入35℃雙抗生理鹽水中，用保溫瓶在3 h 內(nèi)運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室，去除血污。本研究主要目的有兩點(diǎn)：第一，深入探討卵丘細(xì)胞支持卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟的作用機(jī)制；第二，通過(guò)改善體外成熟培養(yǎng)系統(tǒng)，最大限度的提高裸卵的體外成熟及發(fā)育能力，為生發(fā)泡移植和GV期卵母細(xì)胞冷凍保存等技術(shù)提供有效的裸卵成熟方法。目前認(rèn)為，這可能是由于體外成熟的卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟不充分造成的。(2) 去除卵丘細(xì)胞的小鼠卵母細(xì)胞在體外成熟過(guò)程中線粒體由簇狀分布逐漸變?yōu)樯⒉加诼奄|(zhì)內(nèi)，該過(guò)程
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